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目的:原发性肝癌(Primary hepaatocellular carcinoma,PHC)是恶性程度比较高的消化道肿瘤之一,在全球恶性肿瘤发病率居第五位,而死亡率在消化道恶性肿瘤中居第三位。目前原发性肝癌的治疗方法主要包括手术治疗、化疗、放射治疗、介入治疗、射频消融术等方法,而手术治疗面临无法完全切除、术后复发率高、创伤大等问题,近年来随着三维适型放疗及调强放疗技术的发展,放射治疗已经成为肝癌治疗的有效手段。细胞周期是指细胞从第一次有丝分裂结束至下一次有丝分裂结束所经历的过程,分为细胞间期和分裂期。细胞间期又分为G1期、S期与G2期。细胞分裂期(M期),包括前期、中期、后期和末期(G0期),细胞周期从G1→S→G2→M期存在G1/S、G2/M两个检定点,某些突发事件引发的细胞反应使细胞周期停滞在检定点,称为细胞周期阻滞(Cellcycle arrest)。CDC25家族是细胞周期调控的重要因子,CDC25家族蛋白通过调控CDKs的活性来精确调控细胞周期。CDC25家族包括3种同源异构体(CDC25A、CDC25B、CDC25C),CDC25家族是一组苏/酪氨酸双功能酶,其在细胞周期调控中发挥着巨大的作用。CDC25B基因位于人类染色体20p13,研究已经证实,CDC25B过表达可以增加肿瘤细胞的生长,相反抑制CDC25B的表达可以抑制肿瘤细胞的生长,其作用机制是CDC25B可能使肿瘤细胞阻滞在s期或更早,但具体作用机制仍不是特别清楚,有待进一步的研究。CDC25B在细胞周期起着监测点的作用,其在传导通路中处于最终的靶蛋白地位,作为很多通路的最终效应蛋白。目前有人发现CDC25B在胎鼠肝脏中过量表达,提示可能与胚胎发育相关,其在生长发育中起到一定作用。目前对于CDC25B的作用机制仍不十分清楚,有待进一步研究。IER5属于早期慢反应基因家族,是Immediate early response5的简称,人的该基因位于染色体上1q25.3,Williams等人通过实验证实IER5是一种富含脯氨酸且具有多个核酸位点的蛋白,IER5通过磷酸化和(或)去磷酸化作用对外界刺激有快速调节作用,这暗示IER5可能对细胞有丝分裂发挥重要作用。我们的前期研究已经证实辐射可诱导IER5转录水平升高,在辐射诱导细胞凋亡中发挥一定作用。我们前期对AHH1,Hela以及HepG2细胞的研究显示,抑制IER5基因的表达HepG2细胞进入S期的细胞比例增加;增加IER5基因表达HepG2细胞进入S期的比例减少,IER5可以使细胞发生细胞阻滞,诱导细胞凋亡。目前一些学者研究发现在慢性粒细胞白血病细胞中诱导IER5蛋白表达增加,CDC25B mRNA表达随之降低,提示IER5与CDC25B可能存在相互作用,我们推测IER5基因可能通过抑制CDC25B表达参与了细胞周期的调控,本研究旨在探讨辐射诱导HepG2细胞IER5及CDC25B mRNA表达变化情况,以及HepG2细胞IER5表达与CDC25B的相互作用。鉴于国内外尚乏有关肝癌IER5基因表达与CDC25B关系的研究报道,更未见有关辐射诱导HepG2细胞IER5蛋白表达与CDC25B关系的研究报道。因此,本研究拟采用瞬时转染建立IER5低表达HepG2细胞系、采用脂质体介导基因转染技术建立IER5基因高表达HepG2细胞系(前期研究已构建成功),通过反转录聚合酶链反应(Reversetranscription-polymerase chain reaction, RT-PCR)及染色质免疫共沉淀(CHIP)等方法研究在HepG2细胞中,辐射诱导IER5及CDC25B mRNA在细胞周期中的相互作用,IER5蛋白是否通过竞争性结合CDC25B启动子DNA结合位点参与了细胞周期调控。方法:①采用瞬时转染技术建立IER5低表达HepG2细胞系:用脂质体2000作为载体,将前期构建的IER5低表达质粒瞬时转染至HepG2细胞内,同时以转染空载体的细胞作为对照组。②采用脂质体介导基因转染技术建立IER5基因高表达细胞系(命名为HepG2/IER5细胞,前期研究已构建成功)。2Gy、4Gy60Co-γ射线照射过表达、低表达及对照组HepG2细胞,采用RT-PCR检测IER5mRNA及CDC25B mRNA含量;通过染色质免疫共沉淀(CHIP)分析IER5蛋白与CDC25B启动子DNA的相互作用。结果:12Gy、4Gy60Co-γ射线照射后,HepG2细胞IER5及CDC25BmRNA表达的变化:与未照射组(0Gy)相比,照射组HepG2细胞IER5mRNA随着照射后时间的延长表达先上升后下降,6小时表达量最高;与之相反,CDC25B mRNA的含量先下降后上升,6小时达到最低。且4Gy60Co-γ射线照射组较2Gy照射组IER5mRNA表达增加更明显,CDC25BmRNA含量下降更明显,提示IER5与CDC25B可能存在相互拮抗作用。22Gy、4Gy60Co-γ射线照射后,HepG2/IER5细胞IER5及CDC25BmRNA表达的变化:60Co-γ射线照射后,HepG2/IER5细胞与HepG2细胞IER5mRNA变化趋势一致,但含量增加更明显;与此同时,HepG2/IER5细胞CDC25B mRNA含量与HepG2细胞变化趋势一致,且含量下降更明显,增加IER5表达,辐射抑制CDC25B mRNA表达的作用增强,进一步证实IER5与CDC25B可能存在相互拮抗作用。32Gy、4Gy60Co-γ射线照射后,IER5低表达HepG2细胞IER5及CDC25B mRNA表达的变化:60Co-γ射线照射后,与HepG2细胞相比,IER5低表达HepG2细胞IER5mRNA及CDC25B mRNA含量无明显变化,说明抑制IER5表达,60Co-γ射线照射失去了对CDC25B表达的抑制作用,再次佐证了IER5与CDC25B间存在相互拮抗作用。4染色质免疫共沉淀分析研究显示:辐射诱导HepG2细胞IER5mRNA表达增加,IER5蛋白可竞争性的结合CDC25B启动子DNA位点,从而抑制CDC25B的表达,参与了细胞周期的调控。结论:辐射诱导IER5蛋白表达增加,而IER5蛋白可能通过竞争性的结合CDC25B启动子DNA结合位点,抑制CDC25B的表达,使HepG2细胞阻滞在s期或更早,从而导致HepG2细胞凋亡。