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研究背景及目的子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)(以下简称内异症)是常见的妇科良性增殖性疾病,严重影响着女性健康。内异症的确切病因尚不得知,且无针对病因的有效治疗,多年来始终是学者们的研究热点。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA),不参与蛋白质的编码,主要通过与mRNA的3’UTR(Untranslated Region)结合降解靶mRNA控制人类的蛋白编码基因。已有大量8940microRNAs被发现在恶性肿瘤性疾病和内异症等良性疾病发生中发挥重要作用。在前期实验中,我们采用高通量测序的方法建立了 Ems中差异性microRNA和mRNA表达谱。测序结果显示:与在位内膜相比,miR-363-3p在异位病灶中显著下调;MsrB3在异位病灶中显著上调。提示miR-363-3p可能参与子宫内膜异位症的发病,且MsrB3是miR-363-3p生物学预测的靶基因。因此本课题选择miR-363-3p为对象,研究其在子宫内膜异位症中的表达、异常表达对子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells,EnSCs)生物学表型的影响及其机制。本研究共分四个部分。一、miR-363-3p在子宫内膜异位症组织中的表达目的:研究miR-363-3p在子宫内膜异位症在位内膜(eutopic endometrium,Eu)、异位内膜(ectopic endometrium,Ec)及正常内膜(normal endometrium,N)组织中的表达。方法:收集EMs患者Eu、Ec及N组织各30、37、30例。利用实时定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)检测 miR-363-3p 的表达。结果:与Eu相比,miR-363-3p在Ec中显著下调;miR-363-3p在N与Eu之间无显著差异。结论:miR-363-3p在异位内膜中呈低表达。二、子宫内膜异位症患者子宫内膜间质细胞的分离及培养目的:建立合适的Ems研究实验载体。方法:收取EMs患者子宫内膜标本,根据EnSCs与腺上皮细胞在大小、黏附能力之间的差异,通过酶解、过滤及贴壁纯化的方法进行EnSCs的分离培养。并通过免疫荧光法鉴定细胞纯度。结果:EnSCs细胞形态及排列方式与文献相符,活性良好,纯度达90%以上。结论:分离培养出合格的EnSCs,可用于下一步体外实验。三、miR-363-3p对子宫内膜间质细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响目的:探讨miR-363-3p对内异症EnSCs增殖、凋亡及侵袭性等生物学特性的影响。方法:采用脂质体转染技术将体外合成的miRNA阴性对照(miR-NC)和成熟的miR-363-3p 模拟物(mimics)转染入 EnSCs。qRT-PCR检测转染细胞中 miR-363-3p、Caspase3、ki-67、MMP-2和MMP-9的表达。利用流式凋亡检测实验、CCK8细胞增殖检测实验分别检测miR-363-3p组、miR-NC组、Blank组细胞凋亡与增殖变化。结果:mimics可使细胞中miR-363-3p表达升高,约为阴性对照组的150倍;转染miR-363-3p后细胞中Caspase3表达升高,ki-67表达下降,MMP-2和MMP-9表达无明显变化;miR-363-3p可使细胞增殖能力下降,凋亡能力升高。结论:miR-363-3p可降低内异症EnSCs细胞活力,从而抑制内异症的发病。四、miR-363-3p潜在靶基因甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase B3,MsrB3)的鉴定目的:本部分探讨miR-363-3p与MsrB3的关系,寻找miR-363-3p参与内异症发生的可能机制。方法:qRT-PCR及Westemblot分别检测正常内膜、在位内膜和异位内膜组织中MsrB3 mRNA和蛋白的表达。用荧光素酶报告实验及Western blot方法从结合能力和相关性方面验证靶基因。转染MsrB3过表达质粒,CCK-8及流式凋亡实验检测MsrB3对EnSCs的生物学影响。结果:双荧光素酶报告实验证实miR-363-3p与MsrB3具有结合能力;过表达miR-363-3p抑制MsrB3蛋白的表达,而对MsrB3 mRNA的表达无明显影响;过表达MsrB3可逆转miR-363-3p所致细胞增殖力下降及凋亡率升高。结论:MsrB3是miR-363-3p的靶基因,miR-363-3p可能通过调控MsrB3基因的表达,从而降低子宫内膜间质细胞的活力。