本论文主要包括脓毒症患者虚实辩证分型相关临床资料的回顾性分析,脓毒症患者负性共刺激分子PD-1、CTLA-4和Tim-3表达情况及意义,以及参芪扶正注射液对脓毒症免疫功能影响的临床研究三部分。第一部分:脓毒症患者中医辩证分型临床资料的回顾性分析背景:脓毒症是一种因为严重感染而导致的一系列病理、生理方面的异常,是导致全世界感染患者致死、致残的重要因素,亦是医学界关注的焦点问题。中医学认为,脓毒症的病因为外感六淫毒邪,或外伤、烫火伤、中毒等,导致内生热毒、瘀血,或损伤正气,正邪相争,虚实夹杂,终至本病的发生。感染时病原微生物的播散与免疫损伤是脓毒症的两大致病因,免疫反应贯穿于脓毒症病程的始终,免疫功能失衡在脓毒症的发生、发展中发挥重要作用。中医学对免疫的认识源远流长,《内经》中提到“正气存内,邪不可干,邪之所凑,其气必虚”。正气是机体内在的抗病能力,包括抵御病邪、修复机体损害、调节阴阳失衡等;邪气是对机体有损害作用的外部致病因素。当机体正气充足,气血充盈时,免疫功能正常;当机体正气不足时,免疫功能出现紊乱,容易被各种邪气侵袭而导致疾病。在正邪交争时,机体表现为“虚实”,虚证和实证都属于病性的描述,前者是指正气不足,导致脏腑功能衰竭的病理现象,后者则是指邪气实,侵袭力强,导致机体稳态遭到破坏。本研究通过回顾性分析,动态观察患者虚实证素和中医证型的变化情况,探讨脓毒症患者的虚实证候、中医证型与预后的关系,为临床扶正治疗提供依据。目的:分析脓毒症患者的中医证型及症候要素,探讨脓毒症中医证型的临床特点、影响脓毒症发病率和死亡率的相关因素等,从而更好的为运用中医扶正理论对脓毒症患者进行辨证施治提供依据。方法:回顾性分析本院EICU2012年10月至2016年10月期间收治的150例脓毒症患者的临床资料。收集患者入ICU时、第5-7天和第12-14天患者的症状、体征、脏器功能情况、血清乳酸(LAC)、降钙素原(PCT)水平,急性生理与慢性健康评分(APACHE-II)和序贯器官衰竭估计评分(SOFA),同时采集中医虚实症候要素,计算患者28天病死率,并分析相关影响因素。结果:1、患者的一般状况:本次研究共收集150例脓毒症病患年龄在18-80岁之间,平均年龄(59.6±8.5)岁,其中男性患者72例,平均年龄为(58.4±8.6);女性患者78例,平均年龄为(59.1±8.2);男女比例1:1.1。男女患者之间的年龄比较无统计学差异。患者的入住ICU时间为1-59天不等,平均为(31.9±12.7)天。50岁以上年龄段的病患数量明显高于50岁以下的病患。在患者慢性基础病方面,常见的为冠心病、高血压、COPD、慢性肾病、糖尿病、肿瘤、胆结石及脑血管疾病等。2、入住本院EICU脓毒症患者原发感染部位情况本研究中脓毒症患者原发感染部位主要在肺部及腹部。常见疾病中,肺部感染所占比例最大,占54.0%,其次腹部感染,约占25.3%,两者共占79.3%。3、脓毒症患者血流动力学情况:150例脓毒症患者,其中包括脓毒性休克患者54例。94例患者经过治疗后病情好转出院或转回原病房治疗,56例患者死亡,死亡率为37.3%。非休克组患者96人(64.0%),APACHE II评分为21.31±5.23,SOFA评分为8.07±1.22。休克组患者54例(36.0%),APACHE II评分为26.34±6.37,SOFA评分为10.57±1.48。休克组患者SOFA评分和APACHE II评分,显著高于非休克组(P<0.05)。4、脓毒症患者预后情况:本次共分析脓毒症病例150人,其中94例患者经过治疗后病情好转出院或转回原病房治疗,56例患者死亡(37.3%)。患者的性别对于患者的预后未见明显影响。非休克组患者死亡17例,占总死亡人数的30.4%;脓毒症休克组患者死亡39例,占总死亡人数的69.6%。5、从中医证候特征方面分析看:患者入ICU时、第5-7天和第12-14天,均以虚实夹杂证所占比例最高,分别为143例(85.1%),128例(87.7%),119例(95.2%);单纯实证次之,分别为21例(12.5%),16例(11.0%),6例(4.8%)。患者入ICU时、第5-7天和第12-14天,虚实夹杂证患者的APACHE II和SOFA评分均显著高于单纯实证患者(P<0.05),且随着时间的推移APACHE II和SOFA评分呈下降趋势。患者入ICU时、第5-7天和第12-14天,毒热证所占比例呈下降趋势,痰证比例呈上升趋势。虚症症候以气虚证为主,随之为阴虚证和气阴两虚证,阳虚症少许。结论:1、根据“四证四法”理论,对脓毒症患者(入住EICU时)常见的实证证素及虚证证素进行统计,区分为毒热证、瘀血证、急性虚证、腑实证。虚实辨证分型,将脓毒症大致上分为单纯实证和虚实夹杂证,针对患者的虚实证候进行动态观察,随着疾病的发展,存在虚实证候的转变,合并急性虚证的患者比例增加,虚实夹杂证明显增加。虚实夹杂证患者的病情较纯实证患者重,死亡率高。急性虚证贯穿于脓毒症的始终,与脓毒症患者病情的发展及转归密切相关。2、单纯实证患者临床表现虽未见明显虚象,但正气已内耗,在病症上无明显虚象,而病机上已成正虚之态。第二部分:脓毒症患者负性共刺激分子PD-1、CTLA-4和Tim-3表达情况及意义背景:脓毒症是临床危重患者死亡的重要原因之一。感染是导致脓毒症的重要原因之一,免疫功能失衡在脓毒症的发生、发展中亦发挥重要作用,免疫抑制是脓毒症患者病情恶化和死亡的主要原因。PD-1、CTLA-4和Tim-3等负性共刺激分子可负性调节细胞的增殖、分化及凋亡,可能在脓毒症免疫紊乱中发挥重要作用。因此,研究脓毒症患者负性共刺激分子PD-1、CTLA-4和Tim-3的表达及变化情况对揭示脓毒症免疫抑制的发生发展具有重要的意义。目的:通过流式细胞分析技术检测脓毒症患者CD4+和CD8+活化T淋巴细胞表面负性共刺激分子PD-1、CTLA-4、Tim-3以及CD14+单核细胞表面PD-L1的表达情况,探讨负性共刺激分子表达情况与脓毒症患者免疫状态之间的关系。方法:实验采用前瞻、随机、对照的方法进行临床研究。随机选取2012年10月至2016年12月期间大连医科大学附属第一医院急诊ICU收治的成年脓毒症患者,在ICU内继发脓毒症的患者未包含在内。选取同期门诊体检的健康成人20例。使两组在性别构成及年龄分布上无统计学差异,具有可比性。纳入研究的脓毒症患者记录患者在入院后D1、D3及D7天的APACHEⅡ评分、SOFA评分和患者28d的生存状况;检测D1、D3及D7天脓毒症患者外周循环CD4+T及CD8+T表面PD-1/PD-L1、CTLA-4及Tim-3的表达情况。对照组留取标本检测外周循环CD4+T及CD8+T表面PD-1/PD-L1、CTLA-4及Tim-3的表达情况。结果:1、一般资料比较共收集脓毒症患者56例,平均年龄为58.3±13.95岁,其中男性30例,女性26例,男女比例1.15:1;收集健康人员20例,平均年龄57.4土12.26岁,其中男性11例,女性9例,男女比例1.22:1;脓毒症患者28天,死亡率为33.9%。感染的原发部位区分,其中肺部感染24例(42.86),腹腔感染16(28.57),泌尿系感染7(12.5),皮肤软组织感染4(7.14),多发伤5(8.93)。脓毒症组患者APACHE-II评分为22.46±4.67,SOFA评分为8.97±2.35。2、脓毒症患者与对照组外周血T淋巴细胞亚群检测结果比较与对照组比较,脓毒症患者外周血淋巴细胞比例及CD4+T细胞百分比均减少,具有统计学差异。脓毒症组淋巴细胞计数均低于对照组,与对照组比较。3、单核细胞表面HLA-DR及T淋巴细胞表面PD-1/PD-L1、CTLA-4、Tim-3的表达脓毒症患者CD14+单核细胞表面HLA-DR的平均荧光强度(MFI)为439.2±203.34,表达率为52.65%±25.12%,健康对照组CD14+单核细胞表面HLA-DR的平均荧光强度(MFI)为2017.68±405.64,表达率为90.67%±7.65%,两组间比较具有显著性差异。脓毒症患者活化的CD4+T淋巴细胞表面PD-1的表达率为39.22%±12.67%,健康对照组活化的CD4+T淋巴细胞表面PD-1的表达率为10.78%±3.21%,两组间比较,具有统计学差异。脓毒症患者CD8+T淋巴细胞表面PD-1的表达率为29.65%±11.43%,健康对照组CD8+T淋巴细胞表面PD-1的表达率为8.65%±2.64%,两组间比较存在统计学差异。脓毒症患者CD14+单核细胞表面PD-L1的表达率为36.23%±13.64%;健康对照组CD14+单核细胞表面PD-L1的表达率为12.44%±3.78%,两组间比较存在统计学差异;脓毒症组CD8+CTLA-4+的表达率为43.4%±5.2%,健康对照组CD8+CTLA-4+的表达率为37.6%±6.9%,两组间比较存在统计学差异。4、T淋巴细胞表面共刺激分子表达量与脓毒症患者危重病评分的相关性分析。CD4+Tim-3+、CD8+Tim-3+、CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+CTLA-4+表达量与APACHEII评分存在显著的正相关性(均P<0.05);CD4+Tim-3+、CD8+TIM-3+、CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+CTLA-4+表达量与SOFA评分也存在着一定的正相关性(均P<0.05)。Logistic回归分析结果:CD4+PD-1+表达(P=0.003,EXP(B)=1.530,95%CI=1.159-2.018)、CD8+CTLA-4+表达(P<0.001,EXP(B)=1.305,95%CI=1.133-1.503)可能是脓毒症患病的危险因素,CD4+T细胞百分比(P<0.001,EXP(B)=0.574,95%CI=0.453-0.726)可能是脓毒症患病的保护因素。结论:1、脓毒症患者淋巴细胞数目明显减少及CD4+T细胞比例明显下降,提示CD4+T细胞在脓毒症免疫抑制中发挥作用。2、脓毒症患者CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD14+PD-L1的表达率增加,提示PD-1/PD-L1信号通路脓毒症中发挥着重要的作用。可能成为脓毒症治疗的新靶点。3、CD4+PD-1+表达与患者的预后具有相关性可进一步研究能否作为判断患者预后的客观指标,能否作为脓毒症免疫状态评估的预测因子。第三部分:参芪扶正注射液对脓毒症患者免疫功能影响的临床研究背景:脓毒症发病率高、病情重是临床上危重患者死亡的主要原因。目前研究结果显示,免疫功能紊乱、失衡,在脓毒症发病和发展过程中扮演着极其重要的角色。机体免疫防御系统根据不同的应答方式及特点,分为固有免疫应答和适应性免疫应答两类。固有免疫/适应性免疫系统、促炎反应/抗炎反应的失衡是导致脓毒症免疫功能紊乱的重要原因。固有免疫细胞系统的激活,可诱导适应性免疫应答,促炎反应的激活伴抗炎反应的诱导,它们之间相互制约,共同决定了免疫应答的走向,既可以实现免疫稳态,也可能导致过渡的炎症反应(自身免疫损伤)或广泛的免疫抑制(免疫麻痹)。固有免疫是机体抵御外来病原体入侵的第一道防线,外来病原体入侵时,固有免疫中的模式识别受体能够识别病原体相关模式分子,近而启动固有免疫系统发挥效应。补体系统是机体对抗病原体反应的重要组成部分,补体系统的活化会产生具促炎症作用的因子。此外,补体系统与凝血纤溶系统间存在复杂的交互激活网络,表明补体系统过度活化在脓毒症发展过程中具有不良的一面。脓毒血症早期,机体释放大量促炎因子,如TNF-α和IL-6。随着病程延长,出现免疫抑制反应,抗炎细胞因子释放增加,如IL-10。T细胞是获得性免疫的关键细胞,在脓毒症发生和发展过程中,发挥重要作用。本研究旨在通过检测脓毒症患者外周血补体及细胞因子水平,免疫球蛋白水平,观察脓毒症患者T细胞亚群的变化规律。探讨参芪扶正注射液对脓毒症患者固有免疫和适应性免疫状态的影响情况。目的:动态观察参芪扶正注射液对脓毒症患者患者外周血补体、细胞因子水平、免疫球蛋白水平和T细胞亚群的变化规律。方法:实验采用前瞻、随机、对照的方法进行临床研究。选取2012年月至2016年12月大连医科大学附属第一医院急诊ICU收治的脓毒症患者作为研究对象。按照随机原则将入选的脓毒症患者设为脓毒症组(A组)和参芪扶正治疗组(B组)。所有入选脓毒症的患者(A+B组)均参照2012版的《严重脓毒症和脓毒性休克的治疗指南》进行规范化治疗,参芪扶正治疗组(B组)在规范化治疗的基础上应用参芪扶正注射液250ml日1次静脉输注,连用10天。入选的所有脓毒症患者在各观察点(确诊后第1、3、7、10天记录生命体征、血常规、血生化、降钙素元(PCT)、动脉血气分析、血乳酸和补体水平等检测结果,并进行急性生理学与慢性健康状况评分系统及SOFA评分。检测患者外周血补体及细胞因子水平的变化。结果:脓毒症组(A组)、参芪扶正治疗组(B组)患者在年龄、性别、原发病方面无统计学差异1、APACHE-Ⅱ评分:A组与B组在D7和D10观测时间点,APACHE-Ⅱ评分组间比较有统计学差异,A组的分值高于B组;A组在各个时间点D1、D3、D7及D10的APACHE-Ⅱ评分呈下降趋势,B组在各个时间点D1、D3、D7的APACHE-Ⅱ评分呈下降趋势,组内不同观测时间点APACHE-Ⅱ评分之间,存在统计学差异。2、SOFA评分:A组与B组在各个观测时间点D1、D3、D7及D10,SOFA评分呈下降趋势,组间比较具有统计学差异。3、固有免疫相关指标的影响(1)补体:A组D7及D10时C3的表达量,与D10时CH50的表达量较D1时明显升高,具有统计学差异;A组与B组在D3时C3的表达量,组间比较有统计学差异,A组低于B组;A组在D7、D10及B组在确诊后D3、D7和D10时CH50的表达量较D1时明显升高,有统计学差异,A组在D10时与B组在D3、D7、D10时CH50较D1时明显升高,具有统计学差异。(2)、细胞因子:A组在D7及D10时IL-6和TNF-α较D1时呈下降趋势,具有统计学差异。A组与B组在D7时TNF-α,D7和D10时IL-6的表达量,组间比较有统计学差异,A组高于B组;A组在D7和D10时IL-6及TNF-α,B组在D3、D7及D10时IL-6,B组D7和D10时TNF-α,均较D1时的表达明显下降,具有统计学差异。4、适应性免疫方面的影响(1)免疫球蛋白:A组在D7和D10时Ig G和Ig M,以及D3、D7和D10时Ig A的表达量较D1明显升高,具有统计学差异。A组与B组D3时Ig M的组间比较具有统计学差异;A组低于B组;A组D7和D10及B组D10时Ig G的表达较D1时明显升高,具有统计学差异;A组与B组D3、D7和D10时Ig A的表达量较D1时明显升高,具有统计学差异;A组与B组D7和D10时Ig M的表达量较D1时明显升高,具有统计学差异。(2)T淋巴细胞亚群:T淋巴细胞亚群比例:A组D7时CD4+T细胞比例以及D7和D10时CD4+/CD8+细胞比值较D1时明显升高,具有统计学差异;A组在D7时CD4+T细胞比例以及在D7和D10时CD4+/CD8+细胞比值,与B在D7和D10时CD4+T细胞比例以CD4+/CD8+细胞比值均较D1时明显升高,具有统计学差异。淋巴细胞凋亡比例:A组在D3时CD4+T细胞凋亡比例较D1时升高,但无统计学差异;在D7和D10时CD4+细胞凋亡比例明显下降,具有统计学差异;A组与B组在D7时CD4+T细胞凋亡比例组间比较具有统计学差异,A组凋亡比例高于B组;A组与B组在D3时CD4+T细胞凋亡比例较D1时升高,但无统计学差异;在D7和D10时,CD4+T细胞凋亡比例显著下降,具有统计学差异。结论:1、本研究中两组患者APACHEⅡ评分和SOFA评分都呈降低趋势,这表明两组患者病情都在好转,但参芪扶正治疗组两种评分均下降更快,提示参芪扶正注射液可以减轻患者的病情严重程度,缩短恢复时间。2、参芪扶正注射液可能是通过抑制促炎因子的过度释放,阻断炎症介质之间的“瀑布”效应,从一定程度上使促炎与抗炎达到相对平衡状态,减轻全身炎症反应,及早使机体免疫功能得以恢复。3、免疫球蛋白可通过参与识别及吞噬抗原、清除及抑制炎症因子转录、减少免疫细胞凋亡等几种机制发挥免疫调节作用。4、参芪扶正注射液治疗组Ig G水平较对照组高,说明参芪扶正注射液可提高脓毒症患者Ig G的水平,调节其体液免疫功能。5、参芪扶正注射液一定程度能够提升CD4+T细胞,使CD4+/CD8+比值增大,使机体内活化的T细胞相对增多,增强细胞免疫功能,从而改善免疫抑制状态。