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多酚类化合物广泛存在于众多植物中,是中药和药食两用植物的重要有效成分,受到医药界的高度关注。多酚类化合物如白藜芦醇(RES)、槲皮素(QUE)等的药理作用非常广泛,如降血压、抗氧化、抑制脂质过氧化、抗缺血再灌注损伤、抗肿瘤、抗菌等作用都已有报道。多酚类化合物化学性质不稳定、生物利用度低、效价低、半衰期短等缺点也防碍了其开发利用。多甲氧基黄酮是多酚类黄酮的甲基衍生物,具有明显的药代学特点和药效学优势。但天然多甲氧基黄酮的提取工艺至今无重大突破,得量有限,价格昂贵,使深入研究难以进行,我们对QUE进行了甲基化改造,获得高纯度低价位的五甲基槲皮素(PMQ),全新合成了反式三甲基白藜芦醇(trans-TMR)和顺式三甲基白藜芦醇(cis-TMR),克服了药源的瓶颈。本实验拟比较研究PMQ和QUE对正常及H2O2损伤离体大鼠心肌生理特性的影响及其机制,以及比较研究QUE和PMQ,RES、trans-TMR和cis-TMR在乳鼠心肌细胞的抗氧化损伤作用并探讨其可能的作用机制。第一部分比较研究槲皮素和五甲基槲皮素对离体大鼠心肌生理特性的影响目的:比较槲皮素和五甲基槲皮素对心肌生理特性的影响。方法:记录离体大鼠左、右心房肌和心室乳头肌收缩张力、有效不应期、右心房自律性,观察槲皮素和五甲基槲皮素对这些参数的影响。结果:(1)0.1%DMSO对各指标均无明显作用;(2)PMQ 3,10,30,100μmol·L-1,QUE 3,10,30,100μmol·L-1均能增强大鼠离体乳头肌、左心房肌、右心房肌收缩力(P<0.05),随着浓度的增高,其正性肌力作用增强,且同浓度的PMQ比QUE的正性肌力作用弱(P<0.05);(3)PMQ 10,30,100μmol·L-1,QUE 10,30,100μmol·L-1均能增加右心房的自动收缩频率(P<0.05),随着浓度的增高,其正性频率作用增强,同浓度的PMQ比QUE的正性频率作用弱(P<0.05);(4)PMQ100μmol·L-1能缩短左心房肌,心室乳头肌的有效不应期(P<0.05);QUE30,100μmol·L-1能延长左心房肌,心室乳头肌的有效不应期(P<0.05)。第二部分比较研究槲皮素和五甲基槲皮素对H2O2损伤心肌的保护作用目的:比较研究槲皮素和五甲基槲皮素的抗氧化损伤作用。方法:以收缩力为指标,用H2O2(400μmol·L-1)诱发离体大鼠左、右心房肌和心室乳头肌的氧自由基损伤,观察槲皮素(QUE)及五甲基槲皮素(PMQ)抗心肌氧化损伤的作用。结果:在H2O2作用下,离体心肌收缩力先升高后降低,心肌中超氧化物歧化酶活性降低。QUE30μmol·L-1可抑制H2O2对离体左心房肌和右心房肌的负性肌力作用(P<0.01),不影响其对乳头肌的作用。PMQ30μmol·L-1可抑制H2O2对离体乳头肌的负性肌力作用(P<0.05),同时乳头肌中SOD含量得以一定程度回复,不影响其对离体左心房肌和右心房肌的作用。第三部分几种多酚类化合物及其多甲基衍生物在乳鼠心肌细胞的抗氧化损伤作用目的:研究槲皮素(QUE)、五甲基槲皮素(PMQ)、白藜芦醇(RES)、反式三甲基白藜芦醇(trans -TMR)、顺式三甲基白藜芦醇(cis-TMR)等药物对H2O2氧化损伤的乳鼠心肌细胞的保护作用。方法:建立乳鼠心肌细胞培养方法,制备H2O2损伤心肌细胞模型(MTT法检测),检测药物对心肌细胞的保护作用。结果:H2O2 (350μmol·L-1)孵育12h,心肌细胞活力明显降低(P<0.01)。QUE、PMQ、RES、trans-TMR及cis-TMR均有明显的抗H2O2损伤作用。QUE、PMQ、RES、trans-TMR及cis-TMR产生有统计学意义的心脏保护作用的起始浓度分别为30、0.1、0.3、0.3、0.1μmol·L-1。即QUE的甲基化衍生物PMQ的心肌细胞保护作用比QUE提高2个数量级,近300倍。RES的甲基化衍生物trans-TMR的心脏保护作用与RES相同、cis-TMR的作用略有提高。第四部分五甲基槲皮素对乳鼠心肌细胞内游离钙浓度的影响目的:了解五甲基槲皮素对心肌细胞内游离Ca2+浓度的影响。方法:乳鼠心肌细胞常规培养,应用Fura-2负载细胞,采用钙离子荧光成像系统测定乳鼠心肌细胞内游离钙[Ca2+]i。结果:(1)0.1%的DMSO对乳鼠心肌[Ca2+]i浓度无明显影响;1μmol·L-1PMQ降低乳鼠心肌细胞[Ca2+]i浓度的幅度为32±3%(n=8, P<0.01),而3、10μmol·L-1PMQ对乳鼠心肌细胞[Ca2+]i浓度的影响是先引起一个急速短暂的下降,后又迅速引起上升,两者下降的最大幅度分别为48±1%,42+3%(n=8,P<0.01),其增加的最大幅度分别为42±7%,179±30%(n=8,P<0.01)。(2)乳鼠心肌细胞H2O2 (350μmol·L-1)氧化损伤后,[Ca2+]i出现一个快速急剧升高的高峰,随之立即下降,但仍保持一个相对高的[Ca2+]i环境。心肌细胞与3μmol·L-1PMQ孵育2h后再加入H2O2 (350μmol·L-1),上述快速升钙的过程消失。结论:(1)PMQ对离体心肌具有正性肌力作用,可增加右心房的自律性活动,但较同浓度的QUE作用弱;QUE延长有效不应期,PMQ对有效不应期无明显影响。(2)PMQ30μmol·L-1可抑制H2O2引起的离体乳头肌负性肌力作用,同时使乳头肌中SOD活性得以一定程度回复。(3)QUE、PMQ、RES、trans-TMR及cis-TMR对H2O2损伤的乳鼠心肌细胞有保护作用,QUE和PMQ产生有统计学意义的保护作用的起始浓度分别为30μmol·L-1和0.1μmol·L-1,即PMQ的作用强度明显提高。(4)低浓度(1μmol·L-1)PMQ降低乳鼠心肌细胞内游离钙浓度,高浓度(3、10μmol·L-1)PMQ则增加乳鼠心肌细胞内游离钙浓度;PMQ(3μmol·L-1)取消H2O2损伤增加乳鼠心肌细胞内游离钙浓度的作用。