核酸适配体功能材料选择性吸附霉菌毒素的研究及其在乳制品检测中的应用

来源 :广东药科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liongliong432
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黄曲霉毒素和赭曲霉毒素因在食品中分布面广、检出率高且毒性强而引起关注。针对黄曲霉毒素和赭曲霉毒素的检测方法中应用较广的是ELISA、HPLC及HPLC-MS法,但是由于食品基质复杂多样且霉菌毒素含量低,因此需要合适的前处理手段从样品中富集、分离霉菌毒素(如固相萃取技术)。然而,目前的固相萃取材料受到了吸附选择性和吸附容量的限制,而目前应用最多的免疫亲和柱的价格昂贵、不易生产修饰且容易失活,因此新型的霉菌毒素吸附材料的研发成为研究热点。近年来研究发现核酸适配体(Aptamer)能与特定的靶物质具有特异性亲和结合作用,本文依据筛选出的核酸适配体能分别与赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素M1(AFM1)相互作用,以其作为功能单体进行修饰制备了2种新型的核酸适配体功能材料,分别研究了它们对OTA和AFM1的吸附性能以及富集分离条件,并应用于乳制品中霉菌毒素的检测,其具体研究内容和结果如下:1、采用纳米金(GNPs)比色法研究了核酸适配体与GNPs显色测定条件,加入OTA和AFM1通过650 nm和530 nm的A650/A530的信号变化分别表征了核酸适配体分别与OTA、AFM1之间的相互作用。结果表明,核酸适配体能够使GNPs体系达到一个相对稳定状态,且能拮抗盐对GNPs体系的诱导聚沉作用,当二者处于拮抗平衡临界状态时加入OTA、AFM1,发现两种核酸适配体能分别与OTA、AFM1形成复合物,导致GNPs体系颜色由红色转变为蓝色,表明了它们之间具有较强的特异性结合亲和作用,筛选出的两种核酸适配体(Aptamer-1和Aptamer-2)可作为功能单体制备特异性亲和材料。2、以链霉亲和素磁珠为载体材料,用OTA的核酸适配体(Aptamer-1)作为功能单体,通过链霉亲和素和生物素的生物学识别结合作用制备Aptamer-1功能化磁珠,并研究了其修饰条件和吸附性能。采用UPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析磁珠上Aptamer-1的修饰量,优化了修饰条件:Aptamer-1浓度为0.5μmol/L、20 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH7.2)下修饰4 h。通过UPLC建立OTA的分析方法,优化了Aptamer-1功能化磁珠对OTA富集分离条件:吸附时间为120min、体系中Mg2+浓度为10 mmol/L、K+浓度为5 mmol/L、温度为50℃,10%乙腈-水(v/v)为洗脱溶剂、超声洗脱10 min。吸附选择性实验、等温吸附实验、稳定性实验结果表明:Aptamer-1功能化磁珠仅对OTA有高度特异性亲和作用,吸附容量为38.67μg/g,材料具较高的批次稳定性(RSD不大于1.4%)和时间稳定性(40天内稳定)。3、以羧基微球为载体材料,用AFM1的核酸适配体(Aptamer-2)作为功能单体,通过EDC/NHs介导的酰胺化反应合成Aptamer-2功能化微球,并表征了其修饰和研究了吸附性能。采用UPLC-Q-Orbitrap MS/MS表征磁珠上Aptamer-2的修饰,结果表明Aptamer-2能完全修饰于羧基微球表面。建立UPLC-MS/MS分析AFM1的方法,优化了Aptamer-2功能化微球对AFM1富集分离条件:不需要缓冲溶液体系、溶液pH7、体系中Mg2+浓度为10 mmol/L、洗脱溶剂选择体积分数为75%有机溶剂(甲醇或乙腈)。吸附选择性实验、等温吸附实验、稳定性实验结果表明:Aptamer-2功能化微球对AFM1及其结构类似物有较好的吸附选择性,具有高吸附容量(233.1μg/g)、高批次稳定性(RSD不大于1.7%)和较高的时间稳定性(30天内稳定)。4、基于Aptamer-2功能化微球固相萃取乳制品中AFM1及其结构类似物(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)建立了新型检测方法并进行方法学考察,结果为:溶剂标准工作曲线和基质标准工作曲线的线性方程的相关系数(R2)均大于0.9985,具有良好线性相关性;线性方程斜率比在0.93250.9728内,有轻微的基质效应;运用该方法在牛奶和奶粉中检测AFM1时,检测限分别为0.007μg/kg和0.021μg/kg,检测灵敏度高;空白样品和阳性样品加标回收实验结果表明方法准确度高(加标回收率86.72109.9%)、重现性好(RSD 2.68.7%)。应用于八批乳制品中AFM1及其结构类似物检测,AFM1在其中一种牛奶和其中一种奶粉中检出(分别为0.070μg/kg和0.104μg/kg)。方法能选择性吸附乳制品中AFM1及其结构类似物,检测结果准确度高,重复性好。
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