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玉米核糖体失活蛋白(MaizeRibosome-InactivatingProtein)是在玉米胚乳中特异表达的一种具有RNAN-糖苷酶活性的核糖体失活蛋白。它首先以无活性的单链前体蛋白形式合成,经水解酶酶解形成由非共价键连接的双链活性毒蛋白。
为了探索玉米核糖体失活蛋白z108基因的特性、功能和抗病机制,研究工作从以下几个方面开展:1)建立普通烟草的瞬间表达转化体系,将含有z108基因的农杆菌菌株pCam1301/91-108转化烟草叶肉原生质体,并对其转化细胞进行分子生物学和细胞学验证;2)对转化体进行ToMV病毒的接种试验,检测转化体对病毒的抗性作用;3)分离纯化大肠杆菌pET/91M-108中表达的目的蛋白,并测定z108纯化蛋白的抑菌作用。
主要研究结果如下L
1.烟草原生质体细胞的z108基因转化率为6.82-17.84%。
其中:1)裂解液成分为:1.0%纤维素酶、0.5%离析酶、0.5M甘露醇、5000.0mg/LCaC12,25℃保温12-14小时;2)叶肉原生质体细胞与根癌农杆菌菌株pCam1301/91-108共培养30min,25mg/L潮霉素筛选获得转化体;3)转化体细胞经PCR和RT-PCR佥测证明z10基因已整合到烟草原生质体细胞的核基因组中。
2.z108基因T0代转化体单株中88%为目标基因和报告基因共表达的转化体。
对已有的z108基因烟草转化体进行目的基因及报告基因Gus的PCR检测、RT-PCR、扩增产物酶切鉴定以及基因测序分析,证明z108基因已在烟草植株中转录和表达。
3.z108基因烟草转化体对ToMV病毒有抑制作用。
病毒接种试验结果表明,烟草转化体W9和W802单株均对ToMV病毒的增殖有明显的抑制作用,花叶症状表现较晚,且发病症状不明显。
4.z108纯化蛋白对病原真菌具有抑制作用。
浓度为0.02329-0.04658μg/μl的z108纯化蛋白可完全抑制黄曲霉、黑曲霉、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌分生孢子的萌发。对病原真菌的抑制作用主要表现为:1)抑制孢子萌发;2)抑制芽管伸长;3)抑制菌体细胞的生长。