铁（Ⅱ）/2-酮戊二酸依赖的双加氧酶（2-OGDs）是含铁的非血红素加氧酶超家族中最大的亚家族，广泛分布在病毒，细菌，真菌，植物，哺乳动物和人类中。2-OGDs通过激活惰性C-H键来催化多种化学反应包括羟基化，卤化，闭环，去饱和，差向异构化，扩环，环氧化反应等。2-OGDs可以催化从小分子如氨基酸，生物碱，糖类，非核糖体多肽和聚酮到大的生物分子如蛋白质，脂质，DNA和RNA等发生反应。2-OGDs在许多生物过程中起到重要作用，如参与蛋白质翻译后修饰，脂质代谢，氧感应，DNA和RNA修复和抗生素的生物合成等。此外2-OGDs还是人类疾病的治疗药物靶点，包括癌症，炎症，神经疾病，缺血，病理器官纤维化，贫血和肥胖等疾病的药物靶点。　　2-OGDs属于双加氧酶的特定亚型，需要亚铁作为辅因子，并且需要共底物（2-酮戊二酸）介导分子氧的活化来氧化底物。虽然2-OGDs在催化的反应类型和底物选择方面具有多样性，但它们具有一个共同的特征即2-OGDs催化底物生成产物的同时使2-酮戊二酸氧化脱羧形成琥珀酸和二氧化碳。　　以大肠杆菌K-12MG1655菌落为模板，通过大肠杆菌菌落聚合酶链式反应（PCR）扩增编码琥珀酰辅酶A合成酶的β和α亚基的基因。PCR产物和pET-28a（+）载体用NdeI和HindIII限制酶进行消化后，用T4DNA连接酶（NEB）连接构建了含有T7启动子和β亚基N末端带有组氨酸标签的重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌中，使目的基因在大肠杆菌中表达，并用镍柱纯化得到了琥珀酰辅酶A合成酶。　　通过PCR扩增了Virgibacillus salexigens编码四氢嘧啶羟化酶（Unipro.ID.Q2TDY4）的EctD基因，并通过Gibson assembly在两个BsaI限制性酶切位点之间将EctD基因插入到pASK-IBA3表达载体中，形成了具有tetR/tetA启动子和C末端带有Strep标签的重组质粒。并用Strep-Tactin重力柱纯化了四氢嘧啶羟化酶。　　首先用2-[[三(羟甲基)甲基]氨基]乙磺酸缓冲液稀释磷酸二氢钠母液形成一系列不同浓度的磷酸标准液，与相同体积的显色液混合后测定660nm处的吸光值，扣除空白后，建立了吸光值对于PO43-浓度的标准曲线。为了更好地确定偶联体系中琥珀酰辅酶A的用量，我们首先测定了琥珀酰辅酶A的动力学参数kcat。确定了琥珀酰辅酶A合成酶的用量后，建立了660nm处吸光值关于不同浓度琥珀酸的标准曲线，由于琥珀酰辅酶A合成酶催化琥珀酸发生的反应是pH依赖的可逆反应，琥珀酸不能被完全转化。但与磷酸的标准曲线相比较，在我们选定的反应条件下，琥珀酸的转化率可以达到84%。　　建立好下游的偶联体系后，我们选取了动力学参数已知的四氢嘧啶羟化酶来验证新建立的偶联体系。用我们建立的酶偶联体系检测四氢嘧啶羟化酶催化后的产物混合体系，除了kcat数据有些偏高，可能因为2-酮戊二酸发生了非偶联的脱羧反应或者ATP的自发水解，得到的四氢嘧啶羟化酶的动力学数据与用HPLC的方法直接定量生成的5-羟基四氢嘧啶所获得的动力学数据相当。综观来说，我们的偶联方法测定2-OGDs的酶活力和动力学参数是可行的。　　在我们的研究中，使用的是纯化的铁和2-酮戊二酸依赖的双加氧酶来验证显色体系的有效性，但此体系可能不仅仅局限于纯化的双加氧酶，可以应用到更复杂的体系如细胞裂解液或部分纯化的酶。试验中要注意避免磷酸背景的干扰，提前透析去除或者设置有效的空白。不同生物中琥珀酰辅酶A合成酶的抑制剂已经被报导，有可能影响2-OGDs的活性检测，但这个问题可以通过加入过量的偶联酶来消除。　　由于2-OGDs催化功能的多样性，这个家族中的许多酶具有药用功能。脯氨酰、天冬酰胺羟化酶，组蛋白，DNA/RNA去甲基化酶，γ-丁基甜菜碱羟化酶已经引起了制药行业极大的兴趣。简单的琥珀酰辅酶A合成酶偶联显色法将普遍适用于所有的2-OGDs的活性检测，因为它们都使2-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酸。因此，这种检测方法可以用于促进高通量筛选具有潜在治疗价值的酶抑制剂。　　EB病毒(Epstein–Barr virus,EBV)是一种普遍存在的致癌疱疹病毒，感染了90%以上的人群。核糖核苷酸还原酶(RNRs)在DNA的复制和修复中起着不可或缺的作用，催化核糖核苷酸还原成脱氧核糖核苷酸。NDP(或NTP)还原成dNDP(或dNTP)是从头合成DNA单体的唯一途径。　　所有的核糖核苷酸还原酶都有共同的催化机理，金属辅因子参与活性位点内的保守半胱氨酸残基氧化为硫自由基来起始核苷酸的还原。RNR根据其不同的金属辅因子以及这些辅因子产生半胱氨酸硫自由基的方式分为三类。Ⅰ类RNRs是含有双核金属簇的氧依赖型酶。根据它们的金属辅因子，Ⅰ类RNRs可进一步分为三个亚类。Ⅰ类RNRs的α亚基是催化亚基，含有底物结合位点和形成硫自由基的关键的半胱氨酸残基，β亚基含有起始还原的所必须的金属辅因子。对于Ia和Ib类RNRs，β金属中心的酪氨酸自由基形成后，通过长距离（?35?）的质子偶联电子传递过程诱导α亚基中保守的半胱氨酸残基的氧化。对于Ic类，酪氨酸残基被苯丙氨酸取代，不形成酪氨酸自由基，金属中心的四价锰直接参与催化循环过程中的电子转移。　　通过和其他物种的Ia，Ib和Ic型RNRβ亚基的序列进行对比，我们发现EBV RNR的β亚基的金属配体不同于这几个亚型中的任何一种。除了对应于大肠杆菌Ia型RNR氨基酸第84号位的第一种金属配基外，所有RNRβ亚基中的五种配体都是一致的。在该位置，EBV RNRβ类似于含有谷氨酸的Ic型的RNRβ亚基，而Ia和Ib RNRβ亚基中对应的位置是天冬氨酸。然而，EBV的β亚基也不同于Ic型的，因为对应大肠杆菌第122号位的氨基酸是酪氨酸而不是苯丙氨酸。综合考虑，EBV RNR似乎不同于任何I类RNR亚类。EB病毒只能在B细胞中增殖。已知在B细胞中产生自由基作为防御机制。这种特殊的生活环境使得EBV RNR能利用特殊的氧化剂（例如H2O2and O2-?）来装配高价锰的新型金属辅基。推测EBV的RNR可能属于I类RNR的新亚型是诱人的。我们试图通过体外重构建，然后进行活性测定和光谱表征来研究EBV RNR金属辅基性质。　　RNR是一种经过验证的抗癌和抗病毒药物靶标。许多针对RNR的药物已经开发出来，其中一些正在临床使用，另一些正在进行临床试验。吉西他滨和氯沙星是作用于RNRα亚基的核苷酸类似物，而羟基脲和triapine作用于β亚基通过减少酪氨酸自由基或螯合金属离子来抑制其酶功能。鉴于RNR活性金属辅基的重要性，鉴定EBV RNR金属辅基并进一步研究其生物合成将为开发针对EBV和其它含有这种类型金属辅基的病毒的抗病毒药物提供基础。　　编码EBV RNRβ亚基的BaRF1基因和编码EBV RNRα亚基的BORF2基因由通用生物（安徽）有限公司合成并将目的基因克隆到pET28a中。我们将编码EBV RNR的α和β亚基的质粒分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞中。为了获得脱辅基的β亚基，在IPTG诱导前20分钟将100μM的1,10-菲咯啉加入到LB培养基中。用镍柱一步纯化得到了EBV RNRβ亚基。在细胞裂解液中加入硫酸亚铁铵和抗坏血钠，纯化后的β亚基在紫外扫描下，在410nm处检测到了酪氨酸自由基的吸收峰。脱辅基的β亚基在无痒手套箱中用硫酸亚铁铵重新构建也得到了酪氨酸自由基。由于EBV RNRα亚基溶解性差，我们在α亚基上添加了MBP标签用来增加水溶性，用镍柱纯化得到了带MBP标签的α亚基。之后使用Factor Xa去除MBP标签,得到了正确折叠的α亚基并和带酪氨酸自由基的β亚基混合，测定全酶的催化活性。　　EBV RNR全酶活性测定的最终体积为200μL：0.1μMβ2，1μMα2（相对于β2过量10倍），1mM ATP，20mM DTT和0.5mM CDP，50mM HEPESpH7.6，37℃孵育30分钟。然后将反应后的样品与2μL碱性磷酸酶在37℃孵育2小时，并通过HPLC分析产生的脱氧胞苷的量。酶活实验使用的β2是纯化前在细胞裂解液中加入硫酸亚铁铵和抗坏血钠，该β2可以产生酪氨酸自由基，可以诱导α亚基中保守的半胱氨酸残基的氧化。　　在仅有的一次全酶活性试验中，测到全酶是有活性的，但实验结果无法重复。由于N末端MBP标签分子量很大，如果不去除会影响酶的活性，实验过程中带MBP标签的蛋白也从未检测出活性。带MBP标签的α亚基虽然量比较大，但是容易降解并难以纯化。用Factor Xa酶切去除α亚基的MBP标签时α亚基浓度高时极易沉淀，浓度低时标签去除不完全。酶切纯化过程中损失极大，所以都很难得到纯的α亚基。　　现阶段，α亚基的纯化和水溶性问题是最主要的限速步骤，也许在真核细胞中表达EBV RNRα亚基可以使α亚基得到正确的折叠，溶解度提高，因为EB病毒本身就是在人体的B细胞中繁殖的。此猜想还需要进一步的试验来验证。