黏虫CYP4G200基因的克隆、分子特性和功能研究

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细胞色素P450在昆虫体内广泛存在,既能参与内源物质的合成和分解,又在外源物质的解毒和代谢过程发挥作用,影响昆虫的生长发育。黏虫作为农业上重要的害虫之一,在我国多个地区广泛为害,造成一定的经济损失。本研究在黏虫转录组数据库中获得了一条新的P450基因,通过RT-PCR进行序列验证后,将基因序列分析,对其分子特性进行研究,并通过荧光定量PCR和RNAi技术对其功能进行深入研究,探究其在黏虫外源物质的解毒和对自然环境的适应性方面的重要作用,为P450基因分子靶标的筛选和黏虫的有效防治提供基础依据。主要研究结果如下:(1)本研究获得了一条黏虫P450基因序列。序列总长2081 bp,包含长为1671 bp的开放阅读框,编码556个氨基酸,分子量约为63.25 kDa,等电点为8.43,由国际P450命名委员会命名为CYP4G200,GenBank登录号为MG829854。进化分析表明其与鳞翅目夜蛾科昆虫首先聚类,与鳞翅目非夜蛾科昆虫再聚类,与非鳞翅目昆虫最后聚类,符合形态分类特征。(2)黏虫CYP4G200基因在不同发育阶段和不同组织中均有表达,但表达量存在差异。25龄幼虫,随龄期的增加,基因表达量逐渐升高,6龄幼虫基因表达量最低,预蛹和成虫阶段基因表达量回升,但均显著低于4龄、5龄幼虫基因表达量。黏虫CYP4G200基因在4龄幼虫前肠、中肠、后肠、马氏管、脂肪体和体壁中均有表达。脂肪体中基因表达量最高,为中肠的18.2倍,体壁和马氏管中基因表达量次于脂肪体,分别为中肠表达量的12.7和11.5倍,说明CYP4G200基因可能与外源物质解毒有关。(3)不同剂量的2.5%高效氯氟氰菊酯和20%氯虫苯甲酰胺处理黏虫4龄第1天幼虫不同时间,CYP4G200基因表达存在差异。LD10的2.5%高效氯氟氰菊酯点滴处理下呈先不变,再诱导趋势,LD30处理下呈不变-抑制-诱导趋势,LD50处理下呈先抑制,再诱导趋势。LD10、LD30和LD50均在处理48 h,诱导作用最强,分别为对照组的3.3、1.4和2.3倍,结果显示诱导效应的产生与时间和剂量有关,低剂量比高剂量更早的产生诱导效应。LD10和LD30的20%氯虫苯甲酰胺饲喂黏虫不同时间后,CYP4G200基因的表达均呈现抑制-诱导趋势,LD50处理下呈抑制-不变-诱导趋势。3个剂量均在处理24 h,诱导作用最强,分别为对照组的5.5、10.8和2.9倍,同样说明诱导效应的产生与时间和剂量有关。(4)不同浓度的香豆素和吲哚-3-甲醇饲喂处理4龄第1天黏虫幼虫不同时间,CYP4G200基因差异表达。2个浓度香豆素处理下均呈现先不变后诱导趋势,0.1 mg/mL处理48 h诱导作用最强,为对照组的4.0倍,0.5 mg/mL处理12 h诱导作用最强,为对照组的3.3倍。2个浓度吲哚-3-甲醇饲喂黏虫不同时间,一直呈诱导效应,并且0.5 mg/mL处理12、24和48 h诱导作用显著高于0.1 mg/mL处理。结果说明黏虫CYP4G200基因可能与香豆素和吲哚-3-甲醇的代谢有关。(5)胡椒基丁醚(PBO)对黏虫CYP4G200基因的表达有抑制作用。PBO点滴处理黏虫4龄第1天幼虫不同时间,体内CYP4G200基因的表达均被抑制,抑制效果有先增加后降低的趋势。处理12 h,抑制效果最好,为对照组的0.2倍。(6)RNA干扰黏虫4龄第1天幼虫CYP4G200基因表达后,幼虫对2.5%高效氯氟氰菊酯和20%氯虫苯甲酰胺的敏感性增加。点滴LD30的2.5%高效氯氟氰菊酯处理黏虫24 h,死亡率上升了20%,饲喂LD30的20%氯虫苯甲酰胺处理黏虫24 h,死亡率上升了11.1%。结果说明,黏虫CYP4G200基因参与2.5%高效氯氟氰菊酯和20%氯虫苯甲酰胺的代谢过程。
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