西尼罗病毒是一种蚊子或蜱螨类传播的虫媒病毒，分类学上属于黄病毒属的黄病毒科，为RNA病毒。西尼罗病毒具有致病性高和传染性强的特点，可以导致西尼罗热或西尼罗病毒脑炎，其宿主动物和传播媒介在自然界广泛存在。该病毒具有跨地区进行世界性广泛传播的能力，扩大流行的潜在危险性很大，已经引起世界各国的高度重视。西尼罗病毒的RNA基因组全长约10962bp，包含一个编码十个病毒蛋白的开放阅读框。编码三种结构蛋白(C，E，M)，7种非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。根据E蛋白基因序列差异，西尼罗病毒分为两个病毒株系：株系1病毒能使人致病，分布在北美、欧洲、非洲、亚洲和澳大利亚等地区；株系2病毒只在非洲部分地区的动物中流行。本课题首先采用长片段RT-PCR技术构建了西尼罗株系1病毒(GenBank登录号：AF196835)的cDNA亚克隆，可用于进一步构建西尼罗病毒全长感染性cDNA克隆，以便用于研究西尼罗病毒复制和病理过程的分子机制；其次，制备了西尼罗病毒寡核苷酸基因芯片，为进一步研究多病毒联合检测芯片打下基础。另外设计了寡核苷酸基因芯片的判别程序并将该程序应用于西尼罗病毒寡核苷酸基因芯片检测结果的判别分析。 在西尼罗株系1病毒的cDNA亚克隆构建过程中，使用长片段RT-PCR技术对病毒RNA进行反转录是一个关键步骤。实验中对长片段RT-PCR条件进行了优化：第一，使用两步法的反转录操作流程；第二，使用AMV和PrimeScriptRTase混合酶进行反转录反应。AMV和PrimeScriptRTase在55℃时仍然具有较高的活性，在优化的操作流程中应用50℃进行反转录反应；第三，根据引物Tm对退火温度和延伸温度进行了优化，把PCR引物的退火温度提高到65-67℃。在第二轮的PCR反应中又把延伸温度提高到72℃，大约高于Tm5℃。实验中共设计了4对引物，克隆的基因序列包括了西尼罗株系1病毒序列1-3631和8865-11030。设计的引物上引入相应的限制性酶切位点，通过这些限制性酶切位点可以将克隆片段连接起来，这样为制备西尼罗病毒全长感染性cDNA克隆做好了准备。在5’端的引物引入一个T7启动子位点，可以使用T7RNA聚合酶进行体外转录。所构建的cDNA亚克隆包括了病毒的核衣壳蛋白、M蛋白序列、E蛋白序列、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白2A(NS2A)和非结构蛋白5(NS5)的部分序列，可用于研究西尼罗病毒的感染、复制和病理机制，也可为基因工程疫苗的研制提供材料。 目前，西尼罗病毒检测的传统方法主要有间接免疫荧光、补体结合试验、噬菌斑减少中和试验、血细胞凝集抑制反应和病毒分离技术。这些传统的检测方法一次只能确定或排除一种病毒，不能实现大规模高通量的检测，并且人体对外来病毒产生免疫有一定的时滞，因此这些检测方法在病毒感染的早期诊断中敏感性很低。基因芯片技术为西尼罗病毒的检测提供了一种新的途径。基因芯片检测的对象是DNA或RNA，只要人体内有病毒颗粒就能检测，并能同时对多种病毒进行检测，具有独特的优点。 基因芯片(genechip)又称DNA芯片，是专门用于核酸检测的生物芯片，可分为cDNA芯片和寡核昔酸芯片两种。本课题制备了用于西尼罗病毒检测的寡核苷酸基因芯片。实验中以西尼罗病毒株NY99为材料，将抽提的RNA逆转录后使用限制性显示技术对样品进行荧光标记。针对西尼罗病毒基因设计12条长度为60mer的寡核苷酸探针，然后将探针固定在氨基化的芯片片基上，通过样品与探针的杂交实验筛选高特异性和高灵敏度的寡核苷酸探针。同时我们将黄热病毒、乙脑病毒和登革病毒的样品进行逆转录后使用限制性显示技术对样品进行荧光标记，然后与西尼罗病毒寡核苷酸基因芯片杂交，用来检验探针的特异性。我们使用筛选的探针建立西尼罗病毒寡核苷酸基因芯片系统，为进一步研究多病毒联合检测芯片打下了基础。实验中还对芯片检测灵敏度与RT-PCR检测灵敏度进行了对比研究。将西尼罗病毒的cDNA进行101、102、和103倍稀释，分别进行芯片实验，结果显示：病毒的cDNA原液、101和102倍稀释液都能够检测出西尼罗病毒样品，而103倍稀释液的芯片实验不能检测出西尼罗病毒样品。病毒的cDNA原液、101、102、和103倍稀释液的RT-PCR实验结果显示：病毒的cDNA原液、101、和102倍稀释液能够检测出西尼罗病毒样品，而103倍稀释液的RT-PCR实验不能检测出西尼罗病毒样品。对芯片阳性对照探针的数据进行了统计学分析，差异无显著性意义，说明质控系统稳定。芯片实验与RT-PCR实验结果对比说明病毒检测芯片的灵敏度与普通RT-PCR方法相当。 检测芯片制备的过程中，存在多种因素影响检测结果的判别。如芯片类型、样品的标记方法以及扫描设备和软件等。芯片的检测数据经过扫描提取出来以后，需根据数据对实验结果进行快速准确的判别，而检测芯片的规格和待测的样品各不相同，实验结果的判别标准也不是一成不变的。通常，检测芯片的结果主要由专业人员使用统计软件或者手工计算进行人工判别，人工判别效率低并可能存在错误判别。因此，自动化、高效率的判别程序的开发将加快检测芯片的推广应用。本实验使用VisualBasic6.0初步设计了检测芯片的判别程序，设计的判别程序可以识别芯片扫描仪输出的数据文件，并可根据数据文件内的字段对数据进行自动选定。然后按照不同实验的需要针对相应的字段设置筛选标准和阈值，根据这些筛选标准和阈值实现对检测芯片的判别。判别程序可以查询并注释数据，包括生物芯片的相关信息及探针的生物学信息。判别程序完成分析后，会列出一个详细的判别结果，包括检测芯片中的各个样品的检测结果、参考值的范围等。因此，通过判别程序对芯片扫描数据的分析、抽提和判别，初步实现了检测芯片结果的判别分析自动化。为开发高效、自动化的判别软件打下了基础。 综上所述，本研究采用长片段RT-PCR技术构建了西尼罗株系1病毒的cDNA亚克隆；使用寡核苷酸探针制备了西尼罗病毒基因芯片，并进行了检测芯片灵敏度的实验室验证；设计了检测芯片的判别程序，为实现检测芯片结果的自动化判别打下了基础。结果证实，研制的西尼罗病毒基因芯片可成功用于西尼罗病毒的实验室检测。针对检测芯片设计的判别程序可实现芯片数据的自动化判别分析，进而将芯片扫描、数据提取和结果判别整个过程有机结合，提高了检测芯片应用的效率。