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目的：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又名呕吐毒素(vomitoxin),是由镰刀菌属病原真菌产生的真菌毒素之一。DON广泛污染谷类及其制品,严重威胁人和动物的健康。研究报道DON具有很强的细胞毒性,对于原核细胞、真核细胞等均具有明显的毒性作用,DON可抑制DNA、RNA和蛋白质的合成,抑制线粒体功能并诱导细胞凋亡。其中诱导细胞凋亡是DON发挥致病作用,产生免疫毒性的重要途径之一,也是近年来霉菌毒素研究领域中的热点问题。目前关于DON对细胞毒性研究的报道较多,但关于DON诱导细胞凋亡具体的信号转导机制还很少有报道。鉴于上述情况,本实验选用DON敏感细胞株仓鼠肾细胞BHK-21为研究对象,经DON处理后,观察其对BHK-21细胞的形态学、线粒体膜电位及凋亡通路相关蛋白表达变化的影响,以其探讨DON诱导细胞凋亡的作用机制,为深入研究DON的毒性机理、全面了解DON的生物学作用奠定基础。试验一：本试验将处于对数生长期的BHK-21细胞以不同浓度的DON (DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000ng mL-1)进行处理,另设空白培养基对照组。24h后,倒置显微镜观察细胞的形态学改变,琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。结果显示：不同浓度的DON对BHK-21均有诱导凋亡的作用,各浓度组的凋亡率都显著高于对照组(P<0.05)；细胞DNA发生断裂,形成DNA ladder。试验二：本试验将处于对数生长期的BHK-21细胞以不同浓度的DON (DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000 ng mL-1)进行处理不同时间(6h、12h、24h)后,JC-1染色,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化情况。结果显示：在DON作用时间(24h)相同的情况下,除125 ng mL-1外,其他各浓度组与对照组相比均差异显著(P<0.05),随着DON浓度的增大,线粒体膜电位下降的程度越明显；在DON浓度(2000 ng mL-1)相同的情况下,各试验组与对照组相比均差异显著(P<0.05),随着DON作用时间的延长,细胞线粒体膜电位呈逐渐下降的趋势。采用细胞免疫化学染色检测不同浓度的DON处理对BHK-21细胞中Bax、Bcl-2、p53表达的变化,结果显示,DON处理细胞24 h,Bax、p53蛋白表达显著高于对照组,Bcl-2蛋白表达均低于对照组。试验三：采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)检测不同浓度的DON处理对BHK-21细胞中caspase-3、caspase-9、AIF、caspase-12蛋白表达的变化。蛋白免疫印迹结果显示：caspase-3、caspase-9、AIF、caspase-12蛋白分子量分别为35 KD、47 KD、57 KD、55 KD经SDS-PAGE电泳、转膜后,细胞对照组、DON处理组均在相应位置出现了棕色的阳性条带,且随DON浓度的增加阳性条带颜色逐渐加深,宽度逐渐增加。以actin(42KD)作为内参照,采用图像分析系统对杂交条带进行定量分析,进一步证实给予DON处理可以促进BHK-21细胞中caspase-3、caspase-9、AIF、caspase-12蛋白的表达。