研究背景术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是指患者在麻醉或手术后,大脑加工处理信息的能力受到不同程度损害的一种严重的术后并发症。发生POCD后,患者可以出现注意力、语音能力、思维能力和学习记忆能力等功能下降。通常情况下,患者会在术后1天或几周出现认知功能障碍的表现,有的甚至可以持续几个月。POCD的发生不仅会导致患者的住院时间延长、疾病预后发生恶化、增加术后并发症的发生率和围术期死亡率,还会增加患者远期认知功能障碍(如痴呆)和死亡的风险,严重降低患者的远期生活质量。POCD是手术和麻醉后常见的神经系统并发症,尤其在老年患者中比较常见。近年来,随着中国社会老龄化的不断进展,老年患者越来越多,也有越来越多的老龄患者为了治疗或缓解疾病而需要进行全身麻醉和手术。然而,由于POCD的发生发展涉及了患者术前因素、围术期诱发因素等多种因素的共同作用和相互影响,目前对于老年患者麻醉或手术后POCD发生的机制仍不完全清楚。据报道,老年患者由于衰老而导致的中枢神经系统功能退化、机体对抗应激反应的能力减弱,以及手术创伤和麻醉所导致的机体多个系统功能变化等多种因素联合作用,从而导致了老年患者POCD的发生。越来越多的研究显示,手术创伤所引起的中枢及外周的炎症反应、脑组织中β-淀粉样蛋白(Aβ)代谢异常、神经细胞的氧化应激损伤、胆碱能神经递质和受体失衡、血脑屏障损伤引起中枢神经系统微环境稳定性受损等在POCD的发生发展中起着十分重要的作用。此外,麻醉药物、麻醉方式以及麻醉深度在POCD中的作用越来越引起学者们的重视。研究报道,全身麻醉可能会导致患者出现早期的认知功能障碍。其中全身麻醉中所使用的吸入麻醉剂,如异氟烷和七氟烷,可引起患者脑组织的神经病理学改变,出现神经元的凋亡和A β的增多。此外还有研究显示,麻醉苏醒后患者的某些认知功能障碍的表现可以持续很长一段时间,可能会导致患者出现长期的认知缺陷以及脑结构改变。因此,阐明上述发病机制不仅对揭示全身麻醉的潜在机制具有深远意义,还有助于减少和预防麻醉及手术后并发症的发生。探寻POCD的发生机制、易感因素、预防发生、降低其发生率已成为目前临床麻醉工作中的难点,也是老年患者麻醉的研究热点。川陈皮素是一种多甲氧基黄酮类化合物,提取于柑橘类果实的果皮。川陈皮素因其具有广泛的对健康有益的生理效应,已引起了越来越多的关注。越来越多的研究已证实,川陈皮素不仅发挥显著的抗炎、抗氧化、抗癌的生物活性,还具有抗动脉粥样硬化,调节血糖,保护肝脏等功效。除此之外,越来越多的研究探索发现川陈皮素还具有显著的脑保护、改善学习记忆功能等作用。研究表明,川陈皮素可以有效缓解由阿尔茨海默病A β引起的记忆恶化和记忆丧失;通过调节脑组织中ERK和CREB以及CaMK的磷酸化水平,有效改善脑缺血引起的学习和记忆功能障碍;调节脑组织中胆碱能神经的功能,改善学习障碍;通过降低脑梗死大鼠HIF-1 a和cleaved caspase-3的表达水平、提高VEGF的含量、抑制神经元凋亡;调节帕金森疾病中多巴胺能神经元的活性,抑制小胶质细胞的活化,促进神经营养因子的表达,发挥了显著的预防帕金森病中的神经变性改变,从而起到显著的脑保护作用等。中枢神经系统的氧化应激反应和炎症反应与神经系统损伤、学习记忆能力下降及认知功能损害等疾病过程都密切相关。PI3K/Akt信号通路是机体内十分重要的信号转导通路之一,参与了机体内多种重要的细胞活动,如细胞代谢、抑制凋亡、炎症反应等;PI3K广泛存在于机体的各种细胞中,多种细胞因子和刺激因素都可以激活PI3K;Akt是PI3K重要的下游分子,也是机体内多种信号通路的重要枢纽。有研究报道,PI3K/Akt是NF-κ B重要的上游激活因子,在NF-κ B通路的激活中起着非常重要的作用。NF-κ B是在机体炎症反应的网络系统中参与调控多种细胞因子及炎症介质释放和活性的重要分子通路;PI3K/Akt与NF-κB通路在氧化应激反应的过程中均有非常重要的作用。目前仍鲜有研究报道川陈皮素对于术后认知功能障碍的预防和治疗是否有作用。本研究通过异氟烷麻醉老龄大鼠,建立术后认知功能障碍大鼠模型,探讨腹腔注射川陈皮素是否具有改善模型大鼠学习记忆行为的作用,并探索该作用可能的内在机制。研究目的本研究旨在探讨川陈皮素预治疗是否能有效改善老龄大鼠麻醉后学习记忆能力下降的情况,并探索川陈皮素改善麻醉后学习记忆功能损伤的内在作用机制是否与调节PI3K/Akt-NF-κ B通路所介导的炎症反应和氧化应激反应有关。研究方法1.选取20个月龄的健康雄性Sprayer-Dawley大鼠,体重480-550g之间。将大鼠随机分成四组:1)异氟烷组(n=20,异氟烷+吐温-80);(2)川陈皮素(10)组(n=20,异氟烷+川陈皮素10mg/kg);(3)川陈皮素(25)组(n=20,异氟烷+川陈皮素25mg/kg);(4)假实验组(n=20,氧气+吐温-80)。2.Morris水迷宫训练:在正式开始实验前,所有大鼠均需要进行连续5天的Morris水迷宫实验训练,以此来排除无效研究样本(如不能游泳、视力障碍的大鼠),并使所有大鼠形成稳定的记忆。Morris水迷宫的训练观察项目包括:5天的逃生潜伏期时长和逃生路径长度;最后一天定位航行实验结束后次日,实验动物在靶象限的时间比例和大鼠穿越平台的次数。3.自水迷宫训练结束后第一天起,川陈皮素(10)组和川陈皮素(25)组的大鼠腹腔内分别注射川陈皮素10mg/kg/天或25mg/kg/天,连续注射3天。异氟烷组和假实验组给予同等体积的吐温-80腹腔注射,时间亦为3天。其中前两天为麻醉实施前,第三天为麻醉完全恢复后2小时。4.在第3天,将大鼠置于透明密闭的麻醉诱导箱内(诱导箱大小:50 cm×50 cm×40 cm),箱子一端连接麻醉机,根据分组的不同,分别给予不同比例的异氟烷/氧气。其中,异氟烷组、川陈皮素(10)组和川陈皮素(25)组的大鼠在麻醉诱导箱中100%氧气环境中给予2.0%异氟烷2小时;假实验组大鼠给予单纯氧气。异氟烷组、川陈皮素(10)组和川陈皮素(25)组的大鼠在停止异氟烷吸入以后,继续吸入30 m in 100%的O2,待大鼠恢复清醒后放回饲养笼。5.待麻醉完全恢复后24小时,将各组随机抽取10只大鼠,连续3天对各组大鼠进行Morris水迷宫测试,观察各组大鼠麻醉后连续3天的逃生潜伏期时长、逃生的路径长度;以及第4天在目标象限中花费的时间和大鼠穿越平台的次数,以此来反应各组大鼠的学习记忆功能变化的情况。6.各组大鼠自麻醉完全恢复24h后,分别处死并分离海马组织。采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠海马组织中炎症因子(肿瘤坏死因子-α/TNF-α、白细胞介素-1 β/IL-1 β、白细胞介素-6/IL-6),氧化应激相关蛋白(谷胱甘肽GSH、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA)的含量。使用Western-Bolt测定海马组织中凋亡相关蛋白(Bcl-2,Bax,cleaved caspase-3)以及通道蛋白NF-κ B和p-Akt的表达水平。使用RT-PCR实验技术检测海马组织中通道相关蛋白NF-κ B和p-Akt的基因表达水平。研究结果1.在水迷宫实验中,与假实验组相比,异氟烷组大鼠在麻醉后第1-3天的逃生潜伏期和逃生路径长度显著增加,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.01);与异氟烷组相比,川陈皮素(10)组、川陈皮素(25)组的大鼠在麻醉后第1-3天的逃避潜伏期和逃生路径长度显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05;P<0.01,P<0.01)。此外,与假实验组相比,异氟烷组的大鼠在麻醉后第4天在目标象限中花费的时间以及大鼠穿越平台的次数显著减少,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01);与异氟烷组相比,川陈皮素(10)组、川陈皮素(25)组的大鼠在麻醉后第4天在目标象限中消耗的时间和穿越平台的次数显著增加,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05;P<0.01,P<0.01)。2.与假实验组相比,异氟烷组大鼠海马组织内氧化应激相关物质MDA浓度显著增加,抗氧化物质GSH、GSH-Px和SOD浓度显著降低,差异有统计学意义(四个指标均为P<0.01);与异氟烷组相比,川陈皮素(10)组、川陈皮素(25)组大鼠MDA浓度显著降低,而GSH、GSH-Px和SOD浓度显著增加,差异有统计学意义(NOB-10组均P<0.05;NOB-25组均P<0.01);两种剂量的川陈皮素组之间差异无统计学意义(四个指标均为P>0.05)。3.与假实验组相比,异氟烷组大鼠海马组织内炎症反应相关因子TNF-α,IL-1 β,IL-6的浓度显著增加,差异有统计学意义(三个指标均为P<0.01);与异氟烷组相比,川陈皮素(10)组、川陈皮素(25)组大鼠海马组织内TNF-a,IL-1 β,IL-6的浓度显著降低,差异有统计学意义(NOB-10组均为P<0.05;NOB-25组均为P<0.01);两种剂量的川陈皮素组之间进行比较,差异无统计学意义(三个指标均为P>0.05)。4.与假实验组相比,异氟醚组大鼠海马组织内凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-3蛋白表达显著增加,抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达显著降低,差异有统计学意义(三个指标均为P<0.01);与异氟烷组相比,川陈皮素(10)组、川陈皮素(25)组大鼠海马组织内Bax、cleaved caspase-3蛋白水平显著降低,Bcl-2蛋白水平显著增加,差异有统计学意义(NOB-10组均为P<0.05;NOB-25组均为P<0.01);与川陈皮素(10)组相比,川陈皮素(25)组大鼠海马组织内Bax、cleaved caspase-3蛋白水平显著降低,Bcl-2蛋白水平显著增加,差异有统计学意义(三个指标均为P<0.05)。5.与假实验组相比,异氟烷组大鼠海马组织内NF-κ B通路蛋白表达显著增加,p-Akt通路蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01);与异氟烷组相比,川陈皮素(10)组、川陈皮素(25)组大鼠NF-κ B水平显著降低,p-Akt表达水平显著增加,差异有统计学意义(NOB-10组均为P<0.05;NOB-25组均为P<0.01);与川陈皮素(10)组相比,川陈皮素(25)组大鼠NF-κ B水平显著降低,p-Akt表达水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05)。6.与假实验组相比,异氟烷组大鼠海马组织内通路蛋白NF-κ B的mRNA基因表达亦显著增加,p-Akt的mRNA基因表达显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.01,P<0.01);与异氟烷组相比,川陈皮素(10)组、川陈皮素(25)组大鼠NF-κ B的mRNA基因表达水平显著降低,p-Akt的mRNA基因表达水平显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.05;P<0.01,P<0.01);与川陈皮素(10)组相比,川陈皮素(25)组大鼠NF-κ B的mRNA基因表达水平显著降低,p-Akt的mRNA基因表达水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05)。研究结论1.川陈皮素可以显著降低老龄大鼠麻醉后学习记忆功能的损害,且较大剂量的川陈皮素改善作用更为明显。2.川陈皮素改善大鼠学习记忆功能障碍的作用可能是通过调节PI3K/Akt-NF-κ B通路所介导的中枢神经系统内的炎症反应和氧化应激反应来实现的。