厚壳贻贝新型抗菌肽的分子特征和重组表达

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长久以来,国际社会对抗菌肽的研究主要集中在高等动物和一些低等昆虫方面,海洋抗菌肽研究是近年来兴起的一个热点。作者从浙江省重要经济养殖贝类厚壳贻贝的血清中分离得到两种抗菌活性成分,分别命名为Myticusin-1和Mytichitin。通过Edman降解,获得了二者成熟肽N端部分序列。为了进一步了解二者的基因组成,通过在NCBI提供的数据库中搜索同源核酸序列并以之为模板设计引物,成功克隆得到二者的成熟肽编码序列。“两步法”是作者结合逆转录反应自身及逆转录酶固有的特点,并参阅相关文献案例设计的一套用于克隆cDNA3’端非翻译区(UTR)序列的方案,在本实验中获得了成功。本研究室先前成功构建了厚壳贻贝血细胞cDNA文库,Myticusin-15’端非翻译区是从文库中克隆到的,但并没有得到Mytichitin的5’端非翻译区。经过测序确认目前已经获得了Myticusin-1cDNA全序列,其ORF编码生成Myticusin-1前体肽,全长128aa,前体肽由24个氨基酸长度的信号肽外加104个氨基酸长度的成熟肽组成。编码Mytichitin成熟肽共56aa,包括6个半胱氨酸。运用实时荧光定量PCR进一步研究了二者的组织特异性分布以及细菌诱导后基因丰度变化情况。结果表明,前者主要表达场所为血细胞,并在诱导后36h含量达到峰值;后者主要表达场所为性腺,诱导12h后含量达到峰值。通过基因工程的手段,成功将二者活性肽基因导入pET-28a(+)原核表达载体中。Mytichitin的重组表达获得了成功,分子条带大小符合预期,Myticusin-1的重组表达则有待后续发酵条件优化。上述研究为这两种新型抗菌肽研发成为新型药物分子并最终实现工业化生产奠定了基础。
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