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第一部分骨肉瘤C1)271+细胞亚群肿瘤干细胞特性的研究研究背景：骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤之一,常见于青少年,发病率约6-8/百万。目前有效的治疗方式为手术切除肿瘤,并配合新辅助化疗,虽然大大提高了治疗效果,但是自上世纪70年代以来五年生存率一直维持在70%左右,未有明显改善。肿瘤干细胞理论成为近年来肿瘤治疗的研究热点。肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)理论认为肿瘤组织是由一小部分细胞发展而来,这些细胞具有自我更新、分化、致瘤等特性,在肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用,被称为肿瘤干细胞或肿瘤发生细胞。这种干细胞能够自我更新并分化为普通的肿瘤细胞,进而形成肿瘤组织,如果肿瘤干细胞不能被彻底消除,肿瘤就无法完全治愈。另外,肿瘤干细胞较普通肿瘤细胞具有耐药的特性,对化疗及放疗更具抵抗力,因此常规放化疗在杀伤大部分肿瘤细胞时,却容易使肿瘤干细胞成为”漏网之鱼”,从而导致肿瘤的复发和转移。自从白血病细胞中的肿瘤干细胞被发现以来,人们连续从乳腺癌、脑肿瘤等细胞中分离出相应肿瘤干细胞。在2005年Gibbs首次发现骨肉瘤肿瘤干细胞,通过无血清培养获得的肉瘤球中富含肿瘤干细胞,与普通骨肉瘤细胞相比具有自我更新和分化的潜能,并表达多种干细胞基因。在随后的研究中多种干细胞分子标记被发现,例如CD133、CD117/Stro-1、CBX3/ABCA5、Nanog、Oct3/4等,带有这些标记的细胞亚群都具有干细胞特性。CD271为神经生长因子受体,同时也是骨髓间充质干细胞的表面分子标记。另外,CD271在2010年被证实在人黑素瘤肿瘤干细胞中表达,CD271阳性细胞在体内更具有致瘤的能力。由于骨肉瘤可产生类骨质,可能来源于成骨细胞或具有高分化潜能的骨髓间充质干细胞,因此我们猜想CD271可能也在表达在骨肉瘤的肿瘤干细胞中。本部分我们从骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS、MNNG/HOS三种细胞系中提取CD271+细胞,检测其干细胞特性。我们发现CD271+细胞较CD271-细胞在自我更新、分化、增殖、周期、耐药、干细胞基因表达及体内成瘤等方面更具干细胞的特性,因此可以认为CD271可以作为骨肉瘤干细胞分子标记之一,这也可能为将来骨肉瘤的靶向治疗提供依据。研究目的：1.探索CD271在骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞系中的表达。2.分离CD271+骨肉瘤细胞,研究其肿瘤干细胞特征,证明CD271为骨肉瘤干细胞的分子标记之一。研究方法：1.收集临床骨肉瘤标本(骨母细胞型、软骨母细胞型、纤维母细胞型),应用免疫组化的方法检测骨肉瘤标本中CD271的表达。在人骨肉瘤细胞系SAOS2、 U2OS、MNNG/HOS中进行免疫细胞化学检测CD271的表达,测定CD271在骨肉瘤组织和细胞系中的表达比例。2.对人骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS、MNNG/HOS进行无血清培养形成肉瘤球,检测肉瘤球中CD271+细胞含量。磁珠分选CD271+及CD271+-细胞,分别进行无血清培养,观察两种细胞成球的能力及形成二代肉瘤球的效率,验证其自我更新能力。3.利用免疫磁珠法分选人骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS、MNNG/HOS中CD271+/-细胞,通过免疫荧光、流式细胞术及免疫蛋白印迹的方法检测CD271+和CD271-细胞中的干细胞分子标记Nanog、Oct3/4、STAT3的表达。4.分选人骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS、MNNG/HOS中CD271+及CD271-细胞,对CD271+和CD271-细胞给予顺铂处理,通过计算IC5o判断二者对顺铂的敏感性。Western blotting检测CD271+和CD271-细胞中与耐药有关的蛋白DNA-PKcs、Bcl-2、ABCG2表达的区别,从分子水平解释肿瘤干细胞的耐药机制。5.分选人骨肉瘤细胞系SAOS2、U20S、MNNG/HOS中CD271+和CD271-细胞,通过流式细胞术分别检测细胞周期,观察细胞周期的区别。分别培养CD271+和CD271-细胞,绘制生长曲线,计算倍增时间,比较CD271+和CD271-细胞的增殖能力。6.从人骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS、MNNG/HOS中分选CD271+和CD271细胞,以相同的细胞数分别注射入裸鼠皮下,比较二者的体内成瘤的能力。计算CD271+和CD271细胞的成瘤率、肿瘤瘤体积。获取肿瘤组织进行免疫组化和HE染色,观察肿瘤中CD271的表达。实验结果：1.CD271在骨母细胞型、软骨母细胞型、纤维母细胞型的临床骨肉瘤组织中及骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS、MNNG/HOS中少量表达,表达比例约为组织内0-29%,细胞系内6-8%,表达部位在细胞膜或细胞浆内。2.人骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS、MNNG/HOS经过无血清培养所形成的肉瘤球中富含CD271+细胞,比例显著高于未分选的骨肉瘤细胞群。而经过无血清培养,CD271+细胞较CD271-细胞更具有形成肉瘤球的能力。3.免疫荧光、流式细胞术、western blotting结果显示干细胞分子标记Nanog、 Oct3/4、STAT3在人骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS、MNNG/HOS中CD271+细胞表达量高于CD271-细胞。4.顺铂处理后,人骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS、MNNG/HOS中CD271+细胞IC50高于CD271-细胞,更具有耐药性。CD271+细胞表达更多促进耐药的基因DNA-PKcs、Bcl-2、ABCG2。5.在人骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS、MNNG/HOS中,CD271+细胞增殖能力大于CD271-细胞,倍增时间短,增殖快。CD271+细胞G2/M期较CD271-细胞比例增多,这说明CD271+细胞更具增殖潜能。6.体内试验证明人骨肉瘤细胞系SAOS2、U2OS未能形成肿瘤,MNNG/HOS可形成肿瘤。MNNG/HOS中较少的CD271+细胞即可形成肿瘤,肿瘤的生长速度快,成瘤率高,成瘤需要的细胞少,这说明CD271+细胞较CD271-细胞更具成瘤能力。结论：1.CD271不同类型的骨肉瘤组织(骨母细胞型、软骨母细胞型、纤维母细胞型)及骨肉瘤细胞系(SAOS2、U20S、MNNG/HOS)中少量表达。2.骨肉瘤细胞系中CD271+细胞更具肿瘤干细胞特性,CD271可作为骨肉瘤干细胞表面分子标记之一。速度快,成瘤率高,成瘤需要的细胞少,这说明CD271+细胞较CD271-细胞更具成瘤能力。结论：1.CD271不同类型的骨肉瘤组织(骨母细胞型、软骨母细胞型、纤维母细胞型)及骨肉瘤细胞系(SAOS2、U20S、MNNG/HOS)中少量表达。2.骨肉瘤细胞系中CD271+细胞更具肿瘤干细胞特性,CD271可作为骨肉瘤干细胞表面分子标记之一。第二部分下调DNA依赖蛋白激酶逆转骨肉瘤细胞化疗耐药性作用的研究研究背景肿瘤细胞的DNA损伤修复是导致放化疗抵抗的重要原因之一,临床上放疗及铂类、烷化剂、拓扑异构酶制剂等抗肿瘤药物均能引起细胞DNA破坏,但DNA修复使得肿瘤更易抵抗治疗效果,导致疗效降低、肿瘤耐药、肿瘤复发及转移。DNA依赖蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK)为近年来发现的DNA修复的关键酶,并陆续发现其参与DNA双链断裂修复、端粒维护、免疫球蛋白重组、调节基因放大、P53调控、诱导细胞凋亡等多种细胞活动。DNA-PK属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,是由一个催化亚基(DNA-PK catalytic subunit, DNA-PKcs)和两个调节亚基Ku70、Ku80组成的复合物。DNA双链破坏(DNA double-strand breaks,DSBs)是DNA损伤中最严重的形式,其修复方式有同源重组(homology recombination, HR)和非同源末端重组(non-homology end joining, NHEJ), NHEJ为主要的修复方式,而DNA-PK是NHEJ途径的关键酶。DNA-PK在多种肿瘤组织中表达,如宫颈癌、食管癌、肝胆肿瘤、乳腺癌、鼻咽癌、肺癌等,研究发现DNA-PK在肿瘤组织中的表达高于正常组织,其表达程度与生存率密切相关,DNA-PK与肿瘤的增殖、侵袭、转移也有密切联系,NHEJ机制的异常活跃是导致肿瘤基因组不稳定性的重要原因。DNA-PK过度表达还能够提高肿瘤细胞对放化疗的抵抗性,使肿瘤细胞的存活率显著提高,死亡率下降,且更容易导致肿瘤的复发。DNA-PK可以通过自磷酸化调节活性,目前已发现16个DNA-PKcs磷酸化位点。细胞内的活性氧水平、EGFR核内转移、原癌基因Bcl-2等因素可影响DNA-PK的表达和活性。目前针对DNA-PK的靶向治疗成为肿瘤治疗的研究热点,通过DNA-PK抑制剂LY294002、NU7441、NU7026、小分子化合物、多肽等联合放化疗,可使细胞凋亡率增加,延缓细胞生长周期,提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性。靶向治疗提高了打击的准确性,能够大大降低对正常细胞的杀伤,为肿瘤的无毒治疗提供了依据,具有广阔的应用前景。研究目的：1.观察DNA-PKcs在骨肉瘤细胞系MG63中的表达及其与化疗药物引起的DNA损伤的关系；2.应用DNA-PK抑制剂NU7026和小干扰RNA降低DNA-PK活性和下调DNA-PKcs,观察肿瘤细胞对化疗药物顺铂及足叶乙甙耐药性的改变及研究其改变的分子机制。研究方法：1.用化疗药物顺铂和依托泊苷处理骨肉瘤细胞MG63,通过免疫荧光的方法观察pDNA-PKcs12609及DNA双链断裂标志物YH2AX的表达,PCR检测DNA-PKcs的变化,彗星实验检测DNA双链损伤；另设对照组,用DNA-PK抑制剂NU7026处理细胞后再给予顺铂和依托泊苷,观察相同指标的表达变化,比较两组是否具有差异。2.用小干扰RNA下调DNA-PKcs表达,再给予顺铂或依托泊苷处理,检测IC50。MTT的方法观察干扰前后细胞对药物的敏感性的变化。3.小干扰RNA下调DNA-PKcs,再给予顺铂或依托泊苷处理。流式检测细胞干扰前后细胞凋亡率改变。Western blotting检测干扰前后DNA-PKcs及凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-10的表达。4.小干扰RNA下调DNA-PKcs,再给予顺铂或依托泊苷处理。流式检测细胞干扰前后细胞周期改变。Western blotting检测干扰前后DNA-PKcs及周期相关蛋白CyclinD1和CDK4的表达。结果：1. DNA-PKcs在骨肉瘤细胞中表达,化疗药物处理γH2AX表达增加,pDNA-PKcsT2609表达增加,并有核内转移的现象。pDNA-PKcss2056与DNA损伤无显著关系。2.NU7026能抑制DNA-PKcs活性,降低pDNA-PKcsT2609表达,使药物处理后DNA修复能力下降,γH2AX表达较升高。3.骨肉瘤细胞对化疗药物作用呈浓度依赖性,小干扰RNA下调DNA-PKcs后,骨肉瘤细胞对化疗药物敏感性增加,IC50降低。4.小干扰RNA下调DNA-PKcs后对骨肉瘤细胞MG63进行化疗药物处理,其凋亡比例上升较未干扰并经化疗药物处理的细胞升高,凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-10表达上升。5.小干扰RNA下调DNA-PKcs后对骨肉瘤细胞MG63进行化疗药物处理,细胞周期G1期阻滞较未干扰并经化疗药物处理的细胞更加显著,生长减慢,周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4表达下降。结论：1、DNA-PK骨肉瘤细胞MG63中有表达并参与化疗药物引起的DNA双链断裂的修复。2、靶向下调DNA-PKcs能够通过增加凋亡及抑制细胞周期起到提高其对化疗药物敏感性的作用。