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第一部分p38 MAPK抑制剂体外影响高糖环境中内皮祖细胞功能的实验研究目的 本实验旨在分离、培养及鉴定小鼠骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),体外验证高糖环境对EPCs功能的影响,观察p38 MAPK抑制剂是否可以改善高糖环境中EPCs功能,并比较新型抑制剂RWJ 67657与传统抑制剂SB 203580体外保护EPCs的效能。材料和方法 采用密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离培养出EPCs,通过细胞形态学、细胞免疫荧光染色、流式细胞仪检测细胞表面标记物及体外成管能力多方位鉴定EPCs特性。用含不同浓度葡萄糖的培养液体外培养EPCs,通过MTT、β-半乳糖甘酶细胞衰老、Annexin V细胞凋亡、细胞粘附、迁移、成管及ELISA实验观察高糖对EPCs数量及功能的影响。在高糖培养液(25mM)中分别加入RWJ 67657 (1μM)和SB 203580 (1μM), Western Blot测定p38 MAPK磷酸化水平,并通过上述一系列细胞实验比较EPCs数量及功能的变化。结果 免疫荧光、流式细胞仪检测及体外成管实验结果显示,培养第14天的细胞CD133、CD34和VEGFR2表达均呈阳性,并且在基质胶上能够形成典型的管腔样结构。体外培养的EPCs在高糖环境中增殖能力明显下降,而且随着葡萄糖浓度越高,细胞增殖能力下降程度越高,与甘露醇对照组相比差异显著(P<0.05)。Western Blot显示随着葡萄糖浓度的增加,EPCs的p38 MAPK磷酸化水平逐渐增加,而RWJ 67657和SB 203580可以显著降低细胞p38 MAPK的磷酸化水平(P<0.05)。细胞凋亡和成管实验显示p38 MAPK抑制剂可以明显改善高糖对EPCs存活及成管能力的影响,且RWJ 67657较SB 203580效果更为显著(P<0.05)。此外,p38 MAPK抑制剂能够显著降低高糖对EPCs衰老、粘附、迁移及VEGF分泌的影响(P<0.05)。结论 体外培养的小鼠骨髓源性细胞大部分具有造血干细胞及内皮细胞特性,符合EPCs生物学特性,能在体外增殖并分化为内皮细胞。葡萄糖呈量效性减少EPCs数量并影响其功能,两种p38 MAPK抑制剂均可以改善高糖环境中EPCs功能,且新型抑制剂RWJ 67657与传统抑制剂SB 203580相比,保护EPCs的效能更高、毒性更低。第二部分多功能分子影像探针在野生型和糖尿病型缺血性脑卒中模型鼠中活体示踪内皮祖细胞的实验研究目的应用磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)和近红外荧光成像(near-infrared fluorescence imaging, NIRFI)动态监测移植的外源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),观察其在野生型及2型糖尿病脑卒中模型鼠体内的归巢现象,并在活体状态下评估p38 MAPK抑制剂RWJ 67657对EPCs归巢的影响。材料和方法 构建多功能分子影像探针,以顺磁性螯合物和荧光基团修饰,体外标记培养的小鼠骨髓源性EPCs。将探针标记的或未标记的EPCs经患侧颈内动脉泵入野生型或2型糖尿病小鼠缺血性脑卒中模型体内,移植的细胞量约为106(100μ1),分别于移植后1、3、5、7、10、14天不同时间点进行MR和NIRF成像,成像结束后处死小鼠,电感耦合等离子体质谱仪定量脑组织中的Gd含量,并通过免疫荧光染色在离体水平观察EPCs迁移及归巢情况。结果MRI和NIRFI结果显示,野生型模型鼠脑缺血部位的信号强度在探针标记的EPCs移植后第5天达到峰值,其病灶处信号强度及离体组织Gd含量与探针未标记的EPCs移植组相比具有显著差异性(P<0.05)。免疫荧光染色显示探针标记的EPCs移植后第5天,在脑组织微血管中可以观察到CD 133、CD34、VEGFR2与探针中罗丹明共染的双阳性细胞,说明部分EPCs确实归巢至脑缺血部位。此外,在探针标记的EPCs移植后第5天,糖尿病小鼠脑缺血部位MR和NIRF成像信号强度均显著低于野生型小鼠(P<0.05)。而RWJ 67657连续灌胃显著增加糖尿病小鼠脑缺血部位的信号强度(P<0.05),提示更多的外源性EPCs迁移归巢至脑缺血部位。结论 本实验所建立的双模态成像方法可以用于在体无创监测移植的外源性EPCs。通过该多模态成像方法,观察到2型糖尿病明显降低外源性EPCs归巢至脑缺血部位的数量,连续RWJ 67657灌胃治疗却能够促使更多的外源性EPCs归巢至糖尿病小鼠脑缺血部位。第三部分内皮祖细胞移植和p38 MAPK抑制剂联合治疗糖尿病小鼠缺血性脑卒中的实验研究目的本实验旨在通过T2加权成像(T2-weighted imaging, T2WI)和弥散张量成像(diffusion tensor imaging, DTI),结合组织病理学方法研究内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)移植和RWJ 67657联合治疗对糖尿病小鼠缺血性脑卒中预后的作用。方法小鼠骨髓源性EPCs(约106个)经患侧颈内动脉移植入2型糖尿病小鼠缺血性脑卒中模型体内,RWJ 67657自建模前30min起连续灌胃7天(每天1次、每次50 mg/kg)。分别在建模前及建模后第1、7、14、21天进行模型鼠神经功能评分；在建模后第7天进行T22WI扫描、Western Blot及免疫组化染色；在建模后14天进行DTI扫描及髓鞘碱性蛋白免疫组化染色。结果单独EPCs移植或RWJ灌胃治疗均不能显著改善糖尿病小鼠缺血性脑卒中的预后,尽管RWJ 67657表现出显著的抗炎作用(P<0.05)。RWJ灌胃及EPCs移植联合治疗却可以显著协同促进糖尿病脑卒中后的血管新生(P<0.05)及神经发生(P<0.05)。联合治疗组小鼠在建模第7天Western B lot证实VEGF及BDNF的表达明显增加、T2WI显示脑梗塞体积显著降低,第14天DTI显示脑白质纤维数量增加,第21天神经功能缺陷明显改善(P<0.05)。结论 活体磁共振成像及离体组织学证实EPCs移植和RWJ 67657联合治疗可以加速糖尿病小鼠缺血性脑卒中的恢复,而且这可能是由于促神经、血管因子的表达增加引起。