研究背景和目的异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)已经成为治疗血液系统疾病与一些非血液系统疾病的重要手段之一。移植患者非复发死亡的最主要原因是机会性感染和移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)。严重GVHD往往伴随感染的发生,两者的严重程度相互影响,增加了患者死亡的风险。Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)和巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)是 allo-HSCT 后机会性病毒感染主要的病原体。EBV和CMV均属于疱疹病毒科,在初次感染后能够潜伏于免疫正常宿主细胞中。当机体免疫功能下降时,EBV和CMV可再次激活,引起严重的终末器官疾病和肿瘤性疾病。由于近年来逐渐规范的移植后CMV感染的监测和抢先治疗的应用,CMV的防治已经有了一套相对完整的体系,CMV疾病的发生率较前降低。然而,HSCT后EBV感染尚没有完善的预防和治疗策略,以至于EBV感染/再激活所引起的严重并发症,如移植后淋巴细胞增殖性疾病(post-transplant lymphoproliferative disorder,PTLD)和终末器官疾病,成为allo-HSCT患者病毒性感染死亡的最主要原因。Allo-HSCT患者发生移植后EBV和CMV感染/再激活的危险因素包括强烈的预处理方案,免疫抑制剂尤其是抗胸腺球蛋白(Antithymocyte globulin,ATG)的使用以及HLA配型不合等。随着移植技术的发展和个体化治疗日趋受到重视,患者本身的异质性对疾病包括EBV和CMV感染的影响开始得到关注。基因多态性与疾病的关联研究已经成为迅速发展并成果丰富的领域。目前研究较多的与感染性疾病相关的基因为:人类主要组织相容性复合体即HLA基因和天然免疫相关基因。HLA分子在抗感染免疫方面扮演着重要的角色,HLA基因则是人类染色体中多态性最为丰富的基因,其影响感染性疾病易感性的机制被认为可能与多态性影响HLA分子递呈致病性抗原肽或T细胞识别有关。常见由EBV引起的肿瘤-鼻咽癌和实体器官移植后PTLD与HLA基因多态性的关联已有较多报道。一些研究也证实了 HSCT后CMV再激活和相关疾病与HLA基因多态性存在关联。细胞因子类基因是参与抗病毒免疫的天然免疫相关基因中最为重要的一类基因,其中部分基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)被认为可能与实体器官移植后PTLD以及allo-HSCT后CMV感染/再激活、疾病相关。由于移植人群较为特殊,目前鲜见大宗的造血干细胞移植后EBV和CMV感染/再激活以及相关疾病与基因多态性的关联研究报道。另一方面,我国南北方人群allo-HSCT后EBV相关疾病的发病率可能存在差异,这一差异是否与人群的遗传背景有关值得进一步探讨。另外,有关基因多态性影响EBV和CMV感染/再激活和疾病的机制尚不清楚,目前的观点认为可能与其影响病毒特异性细胞毒性T细胞(CTL)有关。基于这些研究成果,本研究假设:基因多态性参与allo-HSCT后EBV和CMV感染/再激活以及相关疾病的发生与发展,机制可能为影响移植后EBV-CTL和CMV-CTL的重建及EBV和CMV感染时病毒特异性CTL的增殖。其目的在于:通过研究HLA基因和细胞因子基因多态性与allo-HSCT后EBV和CMV感染/再激活及相关疾病的关联,并探讨可能的机制,为预测allo-HSCT后EBV和CMV相关疾病的发生和预后,优化移植供者选择和EBV、CMV相关疾病防治策略提供理论依据。方法1、HLA基因多态性与EBV、CMV感染/再激活和相关疾病的关联性研究:2008年7月至2015年1月在南方医科大学南方医院接受allo-HSCT的血液病患者504例纳入本研究。分析HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-C与HLA-DQB1 和EBV、CMV感染/再激活以及相关疾病的关联,并分析allo-HSCT患者EBV、CMV感染/再激活和相关疾病的危险因素。2、细胞因子基因SNPs与EBV、CMV感染/再激活和相关疾病的关联性研究:选择南方医科大学南方医院血液科2012年3月至2014年12月接受allo-HSCT的血液病患者233例。检测患者及其供者IL-1-511位点(rs16944)、IL-1RN+11100位点(rs315952)、IL-2-330 位点(rs2069762)、IL-4-590 位点(rs2243250)、IL-10-592 位点(rs1800872)、IL-12 +1188 位点(rs3212227)、TNF-α-308 位点(rs1800629)、TGF-β1-509 位点(rs1800469)、TGF-β1+869位点(rs1800470)、IFN-γ+874 位点(rs2430561)10 个 SNPs 的基因型,分析SNPs与EBV、CMV感染/再激活以及相关疾病的关联,并分析allo-HSCT患者EBV、CMV感染/再激活的危险因素。3、移植后早期EBV-CTL免疫重建的研究:选择南方医科大学南方医院血液科2013年11月至2014年9月接受allo-HSCT的血液病病例30例,采用酶联免疫斑点(ELISPOT)检测移植后1个月、3个月、6个月外周血EBV-CTL的水平和发生EBV感染/再激活时外周血EBV-CTL的水平,HLA限制性抗原肽四聚体-流式细胞学检测EBV相关疾病时外周血EBV-CTL的水平。分析移植后EBV-CTL的重建情况,比较不同HLA、细胞因子基因型以及发生EBV感染/再激活和未发生EBV感染/再激活患者移植后EBV-CTL的差异。统计学分析:应用SPSS 13.0软件分析。EBV和CMV感染/再激活组和无感染/再激活组,疾病和非疾病组HLA、细胞因子SNPs基因型频率分布比较采用Pearson χ2检验或Fisher’s确切检验。采用Kaplan-Meier法评估EBV和CMV累积感染/再激活率和相关疾病发生率,危险因素分析采用Cox回归模型。外周血EBV-CTL数量以斑点中位数和范围表示,不同时期、不同基因型、EBV感染/再激活和未感染/再激活组EBV-CTL数量比较采用独立样本的非参数检验。P<0.05认为差异有统计学意义。结果1、HLA基因多态性与EBV、CMV感染/再激活和相关疾病的关联性研究:(1)移植后166例患者发生EBV感染/再激活,51例患者发生EBV相关疾病,1年累积EBV感染/再激活和相关疾病的发生率分别为35.0±2.2%和11.2±1.5%。279例患者发生CMV感染/再激活,7例患者发生CMV相关疾病,1年累积CMV感染/再激活和相关疾病发生率分别为56.1±2.3%和1.5±0.6%。(2)EBV感染/再激活组供受者HLA-B*44的频率均高于非感染/再激活组(患者B*44:4.22%vs 1.18%,p=0.046;供者B*44:4.24%vs 1.18%,p=0.046);危险因素分析显示患者携带HLA-B*44基因型(p=0.008,HR=2.809,95%可信区间[CI]=1.303-6.056)是移植后EBV感染/再激活的危险因素。EBV疾病组患者HLA-B*44、供者HLA-B*46、患者HLA-C*05的频率高于非EBV疾病组(患者B*44:7.84%vs 1.55%,p=0.018;供者B*46:42.00%vs 26.71%,p=0.023;患者C*05:5.00%vs0%,p=0.011),供者HLA-C*03位点在疾病组中的频率低于非疾病组(32.43%vs 50.16%,p=0.041);危险因素分析显示患者携带HLA-B*44基因型(p<0.001,HR=8.163,95%CI =2.786-23.916)、供者携带HLA-B*46基因型(P=0.038,HR=1.816,95%CI =1.033-3.192)是移植后EBV相关疾病的危险因素。(3)CMV感染/再激活组患者HLA-B*46、供者HLA-B*46的频率高于非感染/再激活组(患者B*46:32.26%vs 21.78%,p=0.009;供者B*46:32.73%vs 22.67%,p=0.013);CMV感染/再激活组患者HLA-B*48、供者HLA-B*48、患者HLA-DR*03、供者HLA-DR*03、供者HLA-DR*16、患者HLA-C*08、供者HLA-C*12的频率低于非感染/再激活组(患者B*48:1.43%vs5.78%,p=0.007;供者B*48:1.44%vs 6.22%,p=0.004;患者DR*03:10.39%vs 17.33%,p=0.023;供者DR*03:10.43%vs 17.78%,p=0.017;供者DR*16:7.19%vs 13.33%,p=0.022;患者C*08:11.98%vs 20.48%,p=0.023;供者C*12:5.31%vs 14.39%,p=0.004);危险因素分析显示患者携带HLA-B*46基因型(p=0.020,HR=1.355,95%CI=1.049-1.749)是移植后CMV感染/再激活的危险因素;供者携带HLA-B*48基因型(p=0.027,HR=0.326,95%CI =0.121-0.878)、供者携带HLA-DR*03基因型(p=0.026,HR=0.642,95%CI =0.435-0.948)是移植后CMV感染/再激活的保护因素。2、细胞因子基因SNPs与EBV、CMV感染/再激活和相关疾病的关联性研究:(1)74例患者发生EBV感染/再激活,21例患者发生EBV相关疾病。135例患者发生CMV感染/再激活,5例患者发生CMV相关疾病。(2)EBV感染/再激活组EBV感染/再激活组供者IL-1β-511 TT基因型、供者IL-4-590 TT基因型、患者TNF-α-308 GG基因型的频率高于非感染/再激活组(供者 IL-1β-511TT:31.1%vs17.6%,p=0.021;供者 IL-4-590TT:74.3%vs 54.7%,p=0.004;患者TNF-α-308 GG:90.5%vs 78.0%,p=0.020)。而EBV感染/再激活组供者IL-1β-511 CC基因型、供者IL-1RN+11100 TT基因型、供者IL-2-330 TT基因型、供者IL-4-590 CC基因型、患者TNF-α-308 GA基因型的频率低于非感染/再激活组(供者IL-1β-511 CC:17.6%vs30.2%,p=0.041;供者ILL-1RN+11100 TT:21.6%vs 35.8%,p=0.029;供者 IL-2-330 TT:5.4%vs 19.5%,p=0.005;供者IL-4-590 CC:0%vs 7.5%,p=0.011;患者TNF-α-308 GA:9.5%vs 20.1%,p=0.042);危险因素分析显示供者 IL-4-590TT 基因型(p=0.016,HR=1.907,95%CI =1.130-3.218)、患者 TNF-α-308GG 基因型(p=0.002,HR=3.550,95%CI =1.613-7.812)是移植后EBV感染/再激活的危险因素;供者IL-1RN+11100TT 基因型(p=0.001,HR=0.382,95%CI =0.218-0.670)是移植后EBV感染/再激活的保护因素。EBV疾病组供者IFN-γ +874 AT基因型高于非疾病组(42.9%vs 20.3%,p=0.027)。而EBV疾病组供者IL-1β-511 CC基因型、供者IL-10-592 AA基因型、供者IL-12+1188 AA基因型、供者IFN-γ+874 AA基因型的频率低于非疾病组(供者 IL-1β-511 CC:4.8%vs28.3%,p=0.019;供者 IL-10-592 AA:23.8%vs 50.9%,p=0.018;供者 IL-12+1188 AA:9.5%vs 34.9%,p=0.018;供者 IFN--γ+874 AA:52.4%vs 77.8%,p=0.010)。(3)CMV感染/再激活组供者IL-1β-511 TT基因型、供者IL-12+1188 CC基因型、患者TGF-β1-509 CC基因型的频率高于非感染/再激活组(供者IL-1β-511 TT:28.1%vs 13.3%,p=0.007;供者 IL-12+1188 CC:22.2%vs 5.1%,p<0.001;患者 TGF-β1-509 CC:37.8%vs23.5%,p=0.021)。而 CMV 感染/再激活组供者IL-12 +1188 CA基因型的频率低于非感染/再激活组(45.2%vs 62.2%,P=0.010);危险因素分析显示供者IL-12 +1188 CC基因型(P=0.012,HR=1.698,95%CI =1.123-2.568)、患者 TGF-β1-509 TT 基因型(P=0.004,HR=1.676,95%CI =1.180-2.381)是移植后CMV感染/再激活的危险因素。3、移植后早期EBV-CTL免疫重建的研究:(1)抗原肽 FLY 反应的 EBV-CTL +90 天的 EBV-CTL 高于+30 天(Z=-2.272,p=0.023);抗原肽CLG反应的EBV-CTL +90天的EBV-CTL高于+30天(Z=-2.572,p=0.010)。抗原肽 IVF 抗原肽反应的 EBV-CTL+90 天的 EBV-CTL高于+30 天(Z=-2.600,p=0.009)。(2)发生EBV感染/再激活的患者在移植后+90天抗原肽CLG反应的EBV-CTL高于未发生感染/再激活的患者(Z=-2.722,p=0.004)。(3)HLA-A*0201、*0203、*0207 亚型患者移植后+30d、+90d、+180d 的EBV-CTL差异均无统计学意义。(4)移植后+90天患者IL-1β-511 TT基因型抗原肽FLY反应的EBV-CTL数量高于非TT基因型(Z=-2.041,p=0.048);患者IL-1β-511TT基因型抗原肽SSC反应的EBV-CTL数量高于非TT基因型(Z=-2.042,p=0.048);供者IL-1RN+11100 TT基因型抗原肽SSC反应的EBV-CTL数量低于非TT基因型(Z=-2.042,p= 0.048);患者 IL-2-330 GG 基因型 FLY、SSC、IVF 反应的 EBV-CTL数量均高于非 GG 基因型(FLY:Z=-2.4571,p=0.012;SSC:Z=-2.042,p= 0.048;IVF:Z=-2.652,p=0.006);供者 IL-2-330 GG 基因型 IVF 反应的 EBV-CTL 数量高于非GG基因型(Z=-2.652,p=0.006);患者IL-10-592 AA基因型CLG反应的EBV-CTL数量高于非AA基因型(Z=-2.268,p=0.024)。移植后+180天患者IL-1RN +11100 TT基因型FLY反应的EBV-CTL数量高于非TT基因型(Z=-2.241,p=0.026);供者 IL-2-330 TT 基因型 FLY 反应的 EBV-CTL 数量低于非 TT 基因型(Z=-2.148,p=0.030);患者 TGF-β1 +869 CC 基因型 FLY 反应的EBV-CTL数量高于非CC基因型(Z=-2.038,p=0.048)。结论1、HLA-B*44、-B*46基因型可能与allo-HSCT后EBV感染/再激活或相关疾病存在关联。HLA-B*46,-B*48、-DR*03可能与CMV感染/再激活存在关联。2、IL-1RN +11100、IL-4-590、TNF-α-308 位点 SNPs 可能与 allo-HSCT 后EBV感染/再激活或相关疾病存在关联。IL-12 +1188和TGF-β1-509位点SNPs可能与CMV感染/再激活存在关联。但这些关联有待扩大样本量的进一步研究。3、Allo-HSCT后EBV-CTL在移植后+30天可以检出,+90天部分患者能够达到重建。IL-1β-511、IL-1RN+11100、IL-2-330、IL-10-592、TGF-β1+869位点SNPs可能与移植后EBV-CTL重建相关。但这些结论均需要进一步大样本的研究。