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目的:在人源iPS细胞向心肌细胞定向分化的过程中,通过慢病毒感染过表达转录因子Tbx3或Tbx18,探索人源iPSCs（induced pluripotent stem cells,诱导多能干细胞）能否向窦房结样细胞富集分化。方法:1.人源iPS细胞的培养:使用Bio CISO人源iPS培养基培养iPS细胞（LHpb-Yaab C3）,以1:41:7比例进行传代,复苏和传代时加入ROCK抑制剂减少细胞凋亡,提高克隆存活率。2.人源iPS细胞干性的检测:显微镜下观察稳定传代培养的细胞是否具备iPS细胞的典型特征。运用实时荧光定量PCR技术检测干性基因（Oct3/4、Sox2和Nanog）在iPS细胞中的表达水平。运用免疫荧光方法检测iPS细胞特异性标记物,细胞核转录因子（OCT4、NANOG）和细胞膜蛋白（SSEA4、TRA-1-60）的表达情况。3.人源iPS细胞向心肌细胞定向分化的诱导:细胞融合度接近100%时开始诱导分化,诱导分化当天使用RPMI+B27（-）无胰岛素培养基,并加入GSK3抑制剂CHIR（6μM）,24小时后换成新鲜正常的RPMI+B27（-）培养基,诱导分化第3天加Wnt抑制剂IWP-2（5μM）,第5天换成RPMI+B27（-）培养基,第7天换成RPMI+B27（+）含胰岛素培养基,以后每3天更换一次培养基。4.人源iPS细胞向心肌细胞定向分化的检测:观察记录细胞形态变化和搏动的时间、频率。运用实时荧光定量PCR技术,检测诱导分化细胞的心肌前体细胞特异性基因（ISL1、NKX25）和心肌细胞特异性基因（ACTN1、TNNT2）的表达情况。运用免疫荧光方法,检测诱导分化细胞的心肌前体细胞特异性蛋白（NKX25）和心肌细胞特异性收缩蛋白（c Tn T、α-actinin）以及心房肌标记物MLC-2A、心室肌标记物MLC-2V的表达情况。运用流式细胞技术,检测α-actinin阳性细胞比例。5.人源iPS细胞向窦房结样细胞富集分化的诱导:实验分组,A组:Tbx3过表达组,B组:Tbx18过表达组,C组:病毒阴性对照组,D组:细胞空白对照组。在心肌中胚层阶段（即诱导分化第3天）利用慢病毒感染人源iPS细胞过表达转录因子Tbx3或Tbx18,病毒的感染复数（MOI）值为50。6.人源iPS细胞向窦房结样细胞富集分化的检测:运用实时荧光定量PCR技术检测各组诱导分化的细胞中窦房结特异性转录因子（Tbx3、Tbx18、SHOX2）和窦房结特异性离子通道（HCN1、HCN4）,以及心肌前体细胞特异性标记物NKX25的表达情况。结果:1.在低倍镜下人源iPS细胞呈现出边界清晰、折光性好的克隆样聚集,高倍镜下人源iPS细胞紧密规则排列,细胞体积较小,细胞核大而明显,细胞质较少,核质比高。人源iPS细胞能够高度表达细胞干性基因（Oct3/4、Sox2、Nanog）,与人源胚胎干细胞中相应的干性基因的表达水平相似（均P>0.05）,提示人源iPS细胞具有与人源胚胎干细胞相似的多分化潜能性。免疫荧光结果显示人源iPS细胞能够表达特异性细胞核转录因子（OCT4、NANOG）和细胞膜蛋白（SSEA4、TRA-1-60）,并能够将其定位于相应的细胞核或细胞膜。2.人源iPS细胞经诱导定向分化出的心肌细胞,排列紧密,呈鱼群状或漩涡状生长。在诱导分化第9天开始出现搏动的心肌细胞,随着时间推移,细胞搏动频率和比例均逐渐提高,14天后搏动频率在4090次/分之间,搏动细胞比例约70%左右。诱导分化第3天开始表达心肌前体细胞特异性基因（ISL1、NKX25）和心肌细胞特异性基因（ACTN1、TNNT2）。ISL1基因的表达水平于第5天达到最高,NKX25基因的表达水平于第7天达到最高,随着诱导分化时间的进行,心肌前体细胞特异性基因（ISL1、NKX25）的表达水平逐渐下降,在第28天时仍高于成年人心肌细胞中的表达水平（P<0.05）,提示其成熟度尚不及成年心肌细胞。心肌细胞特异性基因（ACTN1、TNNT2）的表达水平随着培养时间的增加而逐渐增加,在第28天时稍低于成年人心肌细胞中的表达水平（P>0.05）。对诱导分化第21天的细胞进行免疫荧光检测,心肌前体细胞特异性转录因子NKX25的免疫荧光结果呈阳性表达,并能够定位于细胞核。心肌细胞特异性收缩蛋白c Tn T和α-actinin的免疫荧光结果也呈阳性表达,其分布于细胞浆,并可见肌小结横纹样结构。心房肌标记物MLC-2A和心室肌标记物MLC-2V的免疫荧光结果也呈阳性表达。流式细胞术结果显示实验组中α-actinin阳性细胞的比例达到78.5%。3.Tbx3过表达组中,Tbx18、SHOX2以及HCN1的表达水平均高于对照组,仅SHOX2有显著统计学差异（P<0.05）,Tbx18、HCN1无统计学差异（P>0.05）;NKX25的表达水平低于对照组但无统计学差异（P>0.05）。结果提示Tbx3在体外人源iPS细胞向窦房结样细胞富集分化过程中呈现出一定的促进趋势,然而结论依据不足。Tbx18过表达组中各标记物的表达水平与对照组均无明显差异（均P>0.05）,提示Tbx18促进人源iPS细胞向窦房结样细胞分化的作用不明显。结论:1.成功建立人源iPS细胞培养及其干性维持的技术方法。人源iPS细胞具有与人源胚胎干细胞相似的多能性。2.成功建立人源iPS细胞定向分化为心肌细胞的技术平台。3.初步研究结果提示在心肌中胚层阶段过表达转录因子Tbx3、Tbx18无明显促进人源iPS细胞向窦房结样细胞富集分化的作用,但Tbx3呈现出一定的促进趋势,值得进一步探索研究。