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甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor,TR)属于核受体超家族的成员,广泛分布在各种组织中。甲状腺激素通过与甲状腺激素受体结合,作用于转录过程实现其对靶基因的正性/负性调节,对于机体的正常分化发育和代谢平衡具有十分重要的作用。TR存在2种主要的亚型:TRα和TRβ。而由于转录起始点以及剪切方式的不同,每种亚型又包括若干同功体(isoforms)。主要的有TRα1、TRα2、TRα3、TR△α1、TR△α2、TRβ1、TRβ2、TRβ3、TR△β3等。我们新发现的TRβ△亚型,在外显子3、4之间多出了一个外显子N(Novel),产生了一种新的剪接方式,本文将在大鼠肝细胞中对两种剪接方式的关系进行研究。
构建重组质粒:以PCR的方法获得目的片段Luciferage、EGFP、cDNA3N4、cDNA34及Minigene。利用限制性酶切位点,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/Luciferage、pcDNA3.1(+)/EGFP、pcDNA3.1(+)/cDNA3N4-Luciferase、pcDNA3.1(+)/cDNA3N4-EGFP、pcDNA3.1(+)/cDNA34-Luciferage、pcDNA3.1(+)/cDNA34-EGFP、pcDNA3.1(+)/Minigene-Luciferage及pcDNA3.1(+)/Minigene-EGFP。重组质粒经酶切鉴定及测序鉴定,证实构建成功。
突变重组质粒:利用体外定点突变技术,在构建好的重组质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Luciferage、pcDNA3.1(+)/Minigene-EGFP的外显子N区域缺失一个碱基,突变为重组质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-Luciferase、pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-EGFP;又在重组质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-Luciferage、pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-EGFP的外显子4区域缺失两个碱基,突变为重组质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-4del2-Luciferase、pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-4del2-EGFP。突变质粒经测序鉴定,证实构建成功。
体外转染:培养大鼠肝细胞BRL,将构建好的重组质粒以相同摩尔数转染BRL细胞,48个小时后,RT-PCRR扩增转录本,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光,并运用统计学软件分析荧光素酶的活性值。小基因重组质粒逆转录的结果扩增出两条带,说明在在大鼠肝细胞BRL中,两种剪接方式都存在；绿色荧光的观察显示,转染质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-EGFP的细胞,视野中可见多处绿色荧光,转染质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-EGFP的细胞,视野中几乎找不到绿色荧光,转染质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-4del2-EGFP的细胞视野中可见多处绿色荧光；分析荧光素酶的活性值的结果表明,转染质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Luciferase的细胞与转染质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Nde11-Luciferase的细胞,荧光素酶的活性值差别有统计学意义(p<0.05),转染质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Nde11-4de12-Luciferase的细胞与转染质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Nde11-Luciferase的细胞,荧光素酶的活性值差别有统计学意义(p<0.05)；而转染质粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Luciferase的细胞与转染质粒pcDNA3.1(+)/Minigene--Nde11-4de12-Luciferase的细胞差别荧光素酶的活性值没有统计学意义(p>0.05)。
综上结果表明,所构建的小基因模型在大鼠肝细胞中,可以剪接成两种转录本,其中剪接方式形成外显子3N4时产生绿色荧光和荧光的酶活性值都要明显高于剪接方式形成外显子34时产生绿色荧光和荧光的酶活性值。我们可以认为,在大鼠肝细胞中,TRβ△小基因模型以剪接成为外显子3N4为主导。