本研究在支架构建、种子细胞的分离、扩增、种植的基础上,对获得的低分化表皮角质形成细胞及在人工合成支架上同时种植的真表皮两种种子细胞进行了实验研究,以期为组织工程化皮肤的研究提供基础性实验数据.主要研究包括:1.双层胶原海绵支架的制备.利用本研究室自提取的牛腱胶原,经冷冻干燥,戊二醛交联,制备出含有硫酸软骨素的胶原海绵支架,并且通过调整胶原浓度获得了具有不同孔径大小的双层支架,表层支架孔径致密(<20um)能够阻止角质形成细胞的浸润生长,并其提供了生长的平台;下层孔径疏松(70-90um)适合真皮成纤维细胞的生长及移行.通过组织学染色,扫描电镜,吸水性,抗拉强度,酸碱度测定,热性能分析,光电子能谱分析和接触角测定对支架材料进行理化性质的表征,表明具有皮肤组织工程支架必备的理化性质.2.种子细胞的分离、培养.从小儿包皮环切术的术后残块分离人真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞,并进行体外扩增培养.利用丝裂霉素处理过的人成纤维细胞作为滋养层培养角质形成细胞,改进了3T3细胞滋养层培养法.3.细胞外基质在角质形成细胞体外培养中作用的试验研究.通过活细胞粘附率、生长曲线、克隆形成率比较Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤维粘连蛋白,层粘连蛋白四种细胞外基质蛋白对角质形成细胞体外培养的促进作用.结果表明,4种细胞外基质在各环节的促进作用都低于作为对照的培养板的塑料表面,其次Ⅰ型胶原对KC的粘附、增殖和克隆形成有显著的促进作用.4.人工合成支架上同时种植两种种子细胞的实验研究.在单层海绵支架上种植成纤维细胞并培养4周后,在支架的另一侧种植角质形成细胞;在双层支架.的两侧同时种植成纤维细胞和角质形成细胞,初步探讨在高分子支架上同时种植种质细胞的可行性及优势.结果显示,协同种植方法可以缩短更多的制备时间,更能适于临床应用的需要.但并没有明显的促进基底膜形成的作用,估计是因为去细胞真皮保留有部分基底膜成分,而高分子材料支架缺乏这些成分的原因.