论文部分内容阅读
在真核生物的细胞核中,DNA遗传物质主要以染色质的形式存在,DNA缠绕组蛋白八聚体形成核小体,进而包装为染色质。染色质的高度浓缩折叠遮蔽了 DNA顺式调节元件也阻碍了大多数转录因子对DNA序列的特异性结合,影响DNA复制、基因转录、DNA修复等生物过程。染色质重塑因子是一类对染色质有着直接作用的重要蛋白,它通过水解ATP改变DNA和组蛋白八聚体之间的相互作用,使得核小体DNA的可接近性产生变化,保证生命活动的正常进行。而染色质重塑因子定位到靶基因的方式,主要是通过识别并结合染色质中的组蛋白翻译后修饰。水稻是世界主要粮食作物及经典的单子叶模式植物,但是目前对水稻中的染色质变构因子的功能研究还比较少,尤其是结构生物学方面的研究就更少了。水稻染色质重塑因子CHR729属于CHD3亚家族,包含两类组蛋白修饰识别子,PHD锌指和chromodomain。其中PHD锌指识别H3K27me3,这在已知的PHD组蛋白修饰识别中尚属首例。本研究运用结构生物学方法对水稻染色质重塑因子CHR729的PHD结构域进行了表达纯化,晶体生长及结构解析。同时通过MST和ITC实验验证了 CHR729-PHD与H3K27me3的相互作用。并尝试得到PHD与短肽H3K27me3的复合物晶体结构,试图阐明PHD识别H3K27me3修饰这一新型的特异识别方式。主要研究结果如下:1.将CHR729-PHD结构域的78-123片段和67-138片段构建到表达载体pET28b-sumo 和 pGEX-6p-1 上;2.获得了大量高纯度的PHD(78-123)和PHD(67-138)蛋白;3.筛选并优化得到可用于数据收集及结构解析的PHD(78-123)蛋白晶体。4.解析了 PHD(78-123)的晶体结构;5.体外MST和ITC实验验证了 PHD(67-138)与H3K27me3的相互作用;本研究还通过结构和序列比对,并结合MST和ITC实验预测了 CHR729-PHD与H3K27me3的结合位点,后续实验可以突变预测的结合位点,通过生化实验来验证。同时PHD结构域的晶体解析,也为日后得到PHD与H3K27me3的复合物晶体奠定了基础。