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(R)-3-奎宁醇是合成瑞伐托酯、阿地溴铵和索利那新等手性药物的重要中间体。生物催化法因具有反应条件温和、环境友好、选择性高等优点而被用于（R）-3-奎宁醇的合成。常规酶偶联方法催化不对称合成（R）-3-奎宁醇时,羰基还原和辅酶再生过程分别在不同的菌体中进行,底物、产物和辅酶须在细胞间、细胞内外进行交换/扩散,导致生物转化时间延长,效率低,不利于工业化。针对酶偶联方法的缺陷,本课题拟用基因重组和蛋白质工程技术构建一种具有双活性中心、双功能的融合体酶,实现羰基不对称还原和辅酶原位再生同时进行,继而循环使用,以提高生物转化效率。利用亲和固定化技术,构建一种高效、可循环再利用的磁性双功能生物催化剂,建立高效生物催化不对称合成（R）-3-奎宁醇的绿色新工艺。具体内容如下:1.构建双功能融合酶表达载体及诱导目标酶表达。通过基因重组技术将编码羰基还原酶（Ml QR）和辅酶再生酶（GDH）的两个全长基因序列通过柔性连接子连接,全合成编码具有羰基还原和辅酶再生的双功能融合酶（MLG）的全长基因片段。再将mlg基因片段连接到载体pET28a,形成重组表达质粒pET28a-mlg。质粒转化感受态细胞,优化的酶表达条件:16℃、0.2 mM IPTG、诱导表达36 h,能可溶性高表达高活性的双功能融合酶（MLG）。MS确证MLG的氨基酸序列与蛋白质数据库中氨基酸序列匹配良好。MLG中羰基还原活性为3678U/g,辅酶再生活性为5070 U/g。MLG动力学分析显示:对底物3-奎宁酮的Km值为12.06 mM,Kcat/Km为0.39;对底物葡萄糖的Km值为1.62 mM,Kcat/Km为6.08。2.重组全细胞催化不对称合成（R）-3-奎宁醇。优化的生物转化条件为:30℃、pH 7-8、0.2 mM辅酶、葡萄糖（1.5倍底物当量）、底物/重组细胞质量比为24:1。当底物3-奎宁酮载量为486 g L-1时,生物转化时间为5.5 h,GC测定转化率为100%,收率90%,ee值100%,时空产率1505.5 g L-11 d-1。3.可循环磁性双功能生物催化剂的构建。利用共沉淀法合成磁性Fe3O4纳米粒,通过硅烷将螯合剂NTA偶联到磁性纳米粒表面,经Ni2+功能化形成亲和纳米磁珠。基于Ni2+亲和作用固定组氨酸标记的双功能融合酶,形成可循环再利用的磁性双功能生物催化剂。借助马尔文粒度仪、SEM、红外光谱仪、热重分析仪、X-衍射仪、磁性能分析仪等手段表征磁性双功能生物催化剂。粒径约20-40 nm;饱和磁化强度为38.96 emu/g,为超顺磁性。磁性双功能生物催化剂中羰基还原（MlQR）活性为2866 U/g,辅酶再生（GDH）活力为6195 U/g。磁性双功能生物催化剂的酶载量为70.6 mg/g,其中羰基还原和辅酶再生酶活性回收率分别为77.99%、122.18%。4.磁性双功能生物催化剂在合成（R）-3-奎宁醇中的应用。优化的生物转化条件为:30℃,pH 8.0左右,辅酶0.2 mM,葡萄糖（底物的1.5倍摩尔当量）、生物催化剂与底物质量比为1:70,生物转化时间为5.5 h,GC测定转化率为100%,产率90%,ee值100%。按生物催化剂与底物质量比1:40启动生物转化反应,磁性双功能生物催化剂可循环使用11次,每克磁性催化剂可获得产物的相对产量达到312.37g。