本研究拟在依赖输血β地中海贫血患儿中开展酶联免疫吸附法(ELISA)检测PRA，探讨依赖输血地中海贫血患儿的体液致敏水平及其临床意义。 第一章依赖输血的地中海贫血患儿PRA检测及临床意义。 一、研究目的：采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测依赖输血的β地中海贫血患儿的群体反应性抗体(PRA)，探讨依赖输血地中海贫血患儿的体液致敏水平及其临床意义。 二、研究对象和方法： 1.研究对象：2005年3月至12月随机选择在我科临床确诊为β地中海贫血且有依赖输血史(输血次数≥3)的患儿共15例，其中男9例，女6例，年龄(6.15±4.01)岁(1岁～13岁)。β地中海贫血的诊断按实用儿科学第7版的诊断标准，并常规作基因诊断和家系调查证实，入选的15例β地贫患儿经基因诊断均为β0、β+基因纯合子或双重杂合子；按诊断标准，15例均为重型β地贫患儿。 2.实验方法： 2.1标本的采集：所有入选者均抽取静脉血3ml，离心分离血清，-20℃保存待检测。 2.2血清PRA的水平及特异性检测：收集血清标本后，采用美国OneLambda公司提供的莱姆德混合抗原板(LATM)和莱姆德抗原板(LAT)检测PRA，检测方法：依据ELISA原理，采用不同的HLA抗原包被泰萨奇(Terasaki)板，以特异性检测抗HLAIgG抗体。其中LATM为Ⅰ类A、B、C抗原和Ⅱ类DR、DQ抗原混合，各组成2个试验孔，是定性检测。LAT为Ⅰ类A、B、C抗原组成28个试验孔、Ⅱ类DR、DQ抗原组成12个试验孔，是定性与定量分析。主要步骤包括：稀释标准阳性血清和待测血清，分别加入96孔Terasaki板，1小时后洗板，再加辣根过氧化物酶交联的IgG二抗，40分钟后洗板，加入底物避光显色10分钟终止，1小时内测定各孔的吸光度值(A630nm)。仪器为可用于Terasaki板测定的BioTek800NB型酶标仪。计算机自动分析Ⅰ类、Ⅱ类IgG抗体的水平和特异性。检测结果判断标准：以LATM板阴性(PRA＜10％)为无致敏，对LATM阳性的患者行LAT板检测，并根据蓝色孔数目分为低度致敏(10％≤PRA＜50％)、中度致敏(50％≤PRA＜80％)和高度致敏(PRA≥80％)。 三、研究结果： 1.用酶联免疫吸附法对15例临床确诊为β地中海贫血且有依赖输血史(输血次数≥3)的患儿进行PRA水平和特异性检测，结果PRA阳性病例6例，占检测总数40％。PRA强度在14％～75％之间，中位PRA强度为47.5％；PRA阳性组患儿年龄(8.67±3.95)岁、接受输血总时间(96.00±44.99)月分别高于PRA阴性组(4.47±3.24)岁、(40.33±35.14)月，差异有显著性意义(P＜0.05)；PRA阳性组输血总次数(90.17±33.42)高于PRA阴性组(30.11±18.42)，差异有极显著意义(P＜0.01)；两组的开始输血年龄比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。 2.男性地贫患儿与女性地贫患儿的PRA检出率比较：男性地贫患儿的PRA阳性检出率为(2/9，22.2％)，阴性检出率为(7/9，77.8％)；女性地贫患儿的PRA阳性检出率为(4/6，66.7％)，阴性检出率为(2/6，33.3％)；两组的PRA检出率比较，经Fisher精确概率检验(FishersExactTest)，其差异无统计学意义(P=0.136＞0.05)。 3.从依赖输血地贫患儿PRA水平与患儿年龄、开始输血年龄、接受输血总时间、输血总次数之间的Spearman等级相关分析结果中，可见PRA定性与输血总次数、患儿年龄、接受输血总时间呈正相关(rs分别为0.819、0.536、0.567，P分别为＜0.01、＜0.05、＜0.05)；PRA强度与输血总次数、患儿年龄、接受输血总时间呈正相关(rs分别为0.830、0.598、0.622，P分别为＜0.01、＜0.05、＜0.05)；而两者与开始输血年龄无相关关系(P＞0.05)。 四、研究结论： 1.依赖输血地贫患儿中的PRA阳性检出率(6/15、40％)。 2.PRA阳性组的地贫患儿与PRA阴性组比较，其平均年龄较大、平均接受输血总时间较长、平均输血总次数较多。 3.经Spearman等级相关分析结果证实：输血总次数越多、年龄越大、接受输血总时间越长的地贫患儿，其出现PRA强度高的机会越多。 第二章地中海贫血患儿血清特异性PRA影响脐血造血干细胞增殖、分化和凋亡、坏死特征的研究。 一、研究目的：拟在体外将脐血单个核细胞与实验血清(健康儿童AB血型血清，不同水平的特异性PRA血清)、补体联合孵育后，通过体外脐血造血干/祖细胞半固体集落培养，探讨不同水平的特异性PRA对脐血造血干/祖细胞增殖、分化能力的影响；应用流式细胞仪检测脐血造血干/祖细胞凋亡及坏死细胞百分率，探讨不同水平的特异性PRA对脐血造血干/祖细胞凋亡及坏死特征的影响。 二、研究材料和方法： 1.标本来源：脐血(cordblood，CB)来自本院健康足月妊娠剖宫分娩之胎儿脐静脉血，用含肝素的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100ml，共5份。 2.实验方法： 2.1脐血的HLA分型在收集脐血标本时，取出其中的2ml置于EDTA抗凝管中，并振荡摇匀后送HLA-Ⅰ.Ⅱ类抗原分型检测。HLA-Ⅰ类抗原检测采用一步法单克隆抗体技术。HLA-Ⅱ类抗原检测采用序列特异性引物聚合酶链反应技术(PCR-SSP)。由专人检测并报结果。 2.2分离脐血单个核细胞采用Ficoll-Hapaque分离法。 2.3流式细胞仪检测脐血MNC的CD+34细胞百分率流式细胞仪检测脐血MNC中的CD+34细胞，由专人负责并报结果。 2.4脐血MNC与实验血清、补体共孵育后半固体集落培养实验分A～E组。A组：不加血清组(空白对照组、PRA0ul组)；B组：健康儿童AB血型血清组(正常对照组)；C组：PRA50ul组；D组：PRA100ul组；E组：血清补体均不加组(补体空白对照组)。 2.5脐血MNC与实验血清、补体共孵育后凋亡与坏死的观察实验分组：A组：不加血清组(空白对照组、PRA0ul组)；B组：健康儿童AB血型血清组(正常对照组)；C组：PRA500ul组；D组：PRA1000ul组。 三、研究结果： 1.脐血MNC的CD+34细胞含量5份脐血单个核细胞的CD+34细胞为(1.62±0.13)％ 2.PRA对脐血MNC集落的影响在半固体集落培养第7天，A、B、C与D组间两两集落形成情况的比较：A组和B组总集落数、CFU-GM分别为(88.20±9.41)、(79.00±11.39)和(88.60±9.12)、(79.20±10.44)，高于C组(20.60±7.39)、(15.20±4.66)和D组(4.00±2.05)、(1.40±0.51)，经统计学分析，差异有极显著意义(P＜0.01)；其余各组的各种集落数两两比较，差异无显著意义(P＞0.05)。A组与E组比较：两组的各种集落数比较差异均无显著性意义(P＞0.05)。 3.PRA对脐血造血干/祖细胞凋亡、坏死特征的影响流式细胞仪检测结果示：PRA1000ul组的脐血造血干/祖细胞凋亡及坏死细胞百分率的值最高为(77.78±3.75)％，高于PRA500ul组(48.06±4.17)％、PRA0ul组(28.12±4.50)％和正常对照AB血清组(27.00±6.56)％，差异有极显著意义(P＜0.01)；PRA500ul组的脐血造血干/祖细胞凋亡及坏死细胞百分率高于正常对照AB血清组，差异有极显著意义(P＜0.01)，高于PRA0ul组，差异有显著性意义(P＜0.05)；正常对照AB血清组与PRA0ul组的脐血造血干/祖细胞凋亡及坏死细胞百分率比较，经统计学分析，差异无显著意义(P＞0.05)。 四、研究结论： 1.经体外半固体集落培养结果证实：特异性PRA血清对脐血造血干/祖细胞具有损伤作用，对脐血造血干/祖细胞的增殖、分化能力具有显著抑制作用。 2.经Spearman等级相关分析结果证明：在研究浓度范围内，特异性PRA血清对脐血造血干/祖细胞增殖、分化的抑制作用与PRA水平具有相关性：特异性PRA水平越高，其抑制作用越强。 3.流式细胞仪检测结果表明：在体外，特异性PRA血清具有增加脐血造血干/祖细胞凋亡及坏死的作用。 4.经Spearman等级相关分析结果证明：在研究浓度范围内，特异性PRA血清水平与其增加脐血造血干/祖细胞凋亡及坏死的作用具有相关性，PRA水平越高，其增加细胞凋亡及坏死的作用越强，对细胞损伤越严重。 5.特异性PRA对脐血造血干/祖细胞的损伤，在体外可通过以下方面(包括：细胞集落形成能力下降、细胞受损的形态学改变、细胞分裂和形成集落的时间延迟、形成松散、规模小的集落的比例增加、细胞凋亡及坏死增加)反映出来。