耳聋是耳鼻咽喉科的常见病和难治性疾病。在我国,听力障碍残疾者居各类残疾人群之首。由于滥用抗生素、急慢性中耳炎及突发性耳聋得不到及时有效的治疗、噪声的污染不断增加及人口老龄化等诸多因素的影响,我国耳聋的发病率逐年上升。因此,深入探讨耳聋发病机制,开发防聋治聋的药物及治疗手段成为医学上迫切需要解决的难题之一。水杨酸钠,是阿司匹林的活性成分,是目前临床上应用最广泛的抗炎止痛药物之一。然而,在水杨酸类药物使用过程中,常伴随着不少的副作用,尤以耳毒性最为常见,主要表现为耳鸣和听力下降。但其具体作用机制目前仍未完全明了。耳蜗螺旋神经节(SGN)是连接毛细胞与听觉中枢的重要枢纽,也是水杨酸钠耳毒性的重要作用位点。根据近期报道,水杨酸钠作用于体外培养的耳蜗器官几天后,选择性地造成SGN及其神经纤维的损伤,但其具体作用机理尚未明确。为明确水杨酸钠诱导SGN损伤的具体机制,本实验拟采用水杨酸钠作用于体外培养的耳蜗器官,通过免疫荧光染色观察水杨酸钠所致SGN损伤的形态学改变,明确其损伤类型；通过DHE荧光探针观察水杨酸钠处理后培养物中过氧化物阴离子的含量,探讨过氧化物产生与水杨酸钠所致SGN损伤的关系；通过caspase荧光试剂盒观察水杨酸钠处理过程中,SGN中凋亡启动因子caspase-8, caspase-9及凋亡执行因子caspase-3的活动情况,探索水杨酸钠所致SGN凋亡的信号通路。通过上述实验探讨介导水杨酸钠所致SGN凋亡的具体机制。此外,水杨酸钠所致SGN出现明显形态学损伤需要长达数天的时间,那么除了导致处理晚期SGN损伤的直接因素外,很可能有其他机制参与了水杨酸钠处理早期的过程。因此,本实验室还通过免疫荧光染色,观察水杨酸钠处理早期SGN中表面及总体NMDAR1的变化情况。同时,结合western blot技术,量化水杨酸钠处理早期SGN中表面及总体NMDAR1蛋白含量的改变,探讨NMDA受体内化在水杨酸钠处理早期中的作用。通过本实验将有利于揭开水杨酸钠处理早期及晚期导致SGN损伤的具体机制,为进一步研究水杨酸耳毒性提供新的理论根据。实验内容分为以下两部分：一水杨酸钠诱导耳蜗螺旋神经节凋亡机制的研究[研究目的]明确水杨酸钠所致SGN损伤的类型,探讨过氧化物与SGN损伤的关系。[研究方法]以出生2-3天SASCO-Sprague-Dawley大鼠乳鼠为实验动物,体外培养包括corti器及SGN在内的耳蜗器官组织。将培养的耳蜗器官分为正常对照组,3mM、5mM、10mM水杨酸钠处理组,培养48小时或96小时；50μM Z-VAD-FMK组,50μM Z-VAD-FMK+3mM、5mM、10mM水杨酸钠干预组；100μM PyP组,100μM PyP+3mM、5mM、10mM水杨酸钠干预组；0.2mMAP5组,0.2mM AP5+3mM、5mM、10mM水杨酸钠干预组；处理48小时。用抗Ⅲ型β-微管蛋白的单克隆抗体标记SGN,鬼笔环肽标记毛细胞,To-Pro-3标记细胞核。采用caspase荧光试剂盒观察SGN中凋亡启动因子caspase-8, caspase-9及凋亡执行因子caspase-3在水杨酸钠处理后的活动情况。用DHE荧光探针检测培养物中过氧化物阴离子的含量。[实验结果](1)3mM、5mM、10mM水杨酸钠处理48小时或96小时后,均未造成明显的内、外毛细胞缺失或损伤。(2)3mM、5mM、10mM水杨酸钠处理48小时或96小时后,SGN神经纤维出现神经断裂,水泡化,神经纤维束萎缩变细甚至断裂、消失的形态学改变,且这种损伤,呈浓度与时间依赖性。(3)3mM、5mM、10mM水杨酸钠处理48小时或96小时后,SGN胞体萎缩变小,细胞核固缩、碎裂、边集呈典型的凋亡形态学改变,且这种损伤,呈浓度与时间依赖性。培养48小时后,对照组中SGN凋亡率为20.61±6.165%,3mM、5mM、10mM水杨酸钠处理后,SGN凋亡率分别升高到68.34±7.193%,83.80±8.481%,88.14±7.424%(P<0.05)。培养96小时后,对照组中SGN凋亡率为20.76±6.690%,而3mM、5mM、10mM水杨酸钠处理后,凋亡率进一步升高到85.57±9.137%,95.42±4.280%,97.97±2.987%(P<0.05)。(4)处理12小时后,对照组SGN中活性caspase-3,-8和-9的阳性率分别为5.91±5.517%,6.870±3.064%,6.62±3.492%；10mM水杨酸钠处理12小时后,其活性没有明显改变,分别为6.69±6.445%,7.67±2.141%,5.70±3.307%(p>0.05)；而水杨酸钠处理24小时后,caspase活性稍有上升,分别为14.42±6.392%,18.76±12.030%,13.04±7.129%,但仍未有显著差异(p>0.05)；处理48小时后,对照组中caspase-3,-8,-9的活性分别为10.23±4.810%,12.15±6.660%,8.610±2.636%；10mM水杨酸钠处理48小时后各活性caspase显著增加,分别为75.19±10.420%,79.40±11.290%,63.98±9.143%(p<0.05).用泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK(50μM)对水杨酸钠所致SGN凋亡进行干预,分别予3mM、5mM、10mM水杨酸钠共处理后,SGN的凋亡率分别20.32±7.526%,65.55±11.190%,80.13±7.867%,85.69±6.984%,与单独使用水杨酸钠处理无明显差异(P>0.05)。(5)用DHE染色检测10mM水杨酸钠处理48小时后耳蜗器官培养物中过氧化物阴离子的含量发现,过氧化物阴离子染色特异性出现在SGN中,支持细胞及毛细胞中未见有明显DHE染色。对照组SGN中DHE染色阳性率为11.07±3.523%,10mM水杨酸钠处理组中则增长至56.12±8.316%(p<0.05)。用100μM过氧化物抑制剂PyP单独处理48小时后,SGN中DHE染色阳性率为10.40±2.620%,与单纯对照组相比无明显差异(p>0.05)。但当100μM PyP+10mM水杨酸钠干预后,SGN中的凋亡率下降到25.04±6.107%(p<0.05),PyP显著抑制了水杨酸钠处理后SGN中过氧化物阴离子的增长。同时,PyP干预后还明显抑制了水杨酸钠对SGN及其神经纤维的损伤作用。PyP+3mM水杨酸钠干预组中,神经纤维无明显形态学损伤,而PyP+5或10mM水杨酸钠处理后,神经纤维损伤也只有出水泡的改变。PyP+3mM、5mM、10mM水杨酸钠处理后,SGN的凋亡率分别下降到31.86±8.101%,32.68±7.166,35%,71±10.040%,与单独使用水杨酸钠处理组相比差异显著((p<0.05)。(6)用NMDA受体抑制剂AP5对水杨酸钠所致SGN凋亡进行干预,0.2mM AP5,0.2nM AP5+3mM.5mM.10mM水杨酸钠处理后,SGN的凋亡率分别14.95±5.420%,61.39±9.535%,75.56±11.710%,82.58±9.074%,与单独使用水杨酸钠处理无明显差异(P>0.05)。[小结]在体外培养的大鼠耳蜗器官中,水杨酸钠选择性损伤SGN及其神经纤维,并呈浓度和时间依赖性。水杨酸钠诱导的SGN凋亡可同时由caspase依赖性与caspase非依赖性细胞凋亡通路介导,其中caspase通路同时启动了胞外死亡受体相关通路和胞内线粒体通路。水杨酸钠诱导SGN凋亡与超氧化物阴离子产生增加有关,应用超氧化物阴离子抑制剂可部分抑制这种损伤,但NMDA受体抑制剂不能抑制这种损伤。二水杨酸钠作用于耳蜗螺旋神经节早期机制的研究[研究目的]探索NMDA受体内化与水杨酸钠对SGN早期作用机制的关系[研究方法]以出生2-3天SASCO-Sprague-Dawley大鼠乳鼠为实验动物,体外培养耳蜗螺旋神经节组织。设立对照组及3mM水杨酸钠组,分别处理15分钟或6小时。用抗Ⅲ型β-微管蛋白的单克隆抗体标记SGN, To-Pro-3标记细胞核。用抗NMDAR1抗体分别标记SGN表面和总体NMDAR1,再分别用与Alexa Fluor488偶联的二抗标记表面NMDAR1,用与Cy-3偶联的二抗标记总体NMDAR1,观察水杨酸钠处理后SGN表面及总体NMDAR1的表达变化。用生物素标记表面蛋白,结合Western blot技术检测水杨酸钠处理前后SGN表面及总体NMDAR1蛋白的变化。[实验结果](1)3mM水杨酸钠处理15分钟或6小时均未造成SGN显著形态学损伤。(2)3mM水杨酸钠处理15分钟后,SGN表面NMDAR1表达明显下降,总体NMDAR1无明显改变。(3)3mM水杨酸钠处理15分钟后,与对照组相比SGN表面NMDAR1蛋白明显下降,下降率为38.15%(p<0.05)；处理6小时后,与对照组相比SGN表面NMDAR1蛋白无明显改变(p>0.05)。(4)3mM水杨酸钠处理15分钟后,与对照组相比SGN总体NMDAR1蛋白无明显变化(p>0.05)；处理6小时后,与对照组相比SGN总体NMDAR1蛋白表达增高1.90倍(p<0.05)。[小结]水杨酸钠处理早期,SGN未出现明显形态学损伤之前,短期处理可诱导SGN表面NMDAR1内化,较长时间处理后可诱导总体NMDAR1表达增高。[总体结论](1)水杨酸钠可选择性诱导SGN凋亡,并呈浓度和时间依赖性。(2)水杨酸钠诱导的SGN凋亡与caspase依赖通路及caspase非依赖通路均相关,其中caspase通路同时启动了胞外死亡受体相关通路和胞内线粒体通路。(3)水杨酸钠诱导的SGN凋亡与过氧化物阴离子产生增高有关,选择性应用过氧化物抑制剂可抑制水杨酸钠对SGN的损伤,但NMDA受体抑制剂不能抑制这种损伤。(4)水杨酸钠处理早期,SGN未出现形态学损伤前,短期处理可诱导SGN表面NMDAR1内化,较长时间处理后可诱导总体NMDAR1表达增高。