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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性致死性传染病,现阶段,猪瘟的防控通常采用猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)进行接种预防,该疫苗是世界上公认的最有效和安全的弱毒疫苗,对猪瘟的防控起到了重要的作用。然而,在免疫良好的猪场仍有猪瘟的病例的发生,CSFV与牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)同属于黄病毒科、瘟病毒属,存在抗原相关性和交叉反应性,两者自然条件下感染猪,其临床症状和病理变化相似,加大了临床诊断的困难。为了解山东地区CSFV的流行状况和更好地进行CSFV的监测,本试验建立了双重荧光RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,并对成功分离的CSFV的C、E0、E1基因和E2部分基因进行了克隆测序和遗传进化分析。为建立CSFV和BVDV的鉴别检测方法,根据Genbank公布的基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,以构建的CSFV Npro和BVDV 5′-UTR的阳性重组质粒作为阳性质控品,优化反应条件,建立了双重RT-qPCR检测方法。以阳性质控品和常见病毒为模板进行了特异性、灵敏性和重复性试验,并应用于临床检测。结果,CSFV和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μl,特异性强、稳定性好。应用所建立的RT-qPCR方法和本实验室常用单项CSFV RT-qPCR试剂盒和单项BVDV RT-qPCR试剂盒对本实验室2016年采集的206份猪病料进行检测,结果显示CSFV阳性59份、BVDV皆为阴性,与常用单项CSFV和BVDV RT-qPCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重RT-qPCR整个检测过程不到3h,采取闭管反应,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点,可用于CSFV和BVDV的临床鉴别检测,且BVDV-1和BVDV-2皆能检出,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。本研究采取体外培养技术,选取来自济南、德州、临沂、泰安、日照、淄博、济宁等地区的26份CSFV阳性病料接种PK15细胞进行病毒分离,成功分离了26株CSFV,分别命名为SDJN-1、SDJN-2、SDJN-3、SDJN-4、SDJN-5、SDDZ-1、SDDZ-2、SDDZ-3、SDQH-1、SDQH-2、SDQH-3、SDQH-4、SDQH-5、SDQH-6、SDQH-7、SDXJ-1、SDXJ-2、SDXJ-3、SDLY-1、SDLY-2、SDRZ-1、SDZB-1、SDTA-1、SDTA-2、SDSS-1、SDLS-1。采用猪瘟野毒荧光RT-PCR试剂盒对26株分离株进行了检测,结果表明其皆为野毒株。采用分子克隆技术对已分离的26株CSFV C、E0、E1基因和E2部分基因序列进行扩增、克隆、测序,并利用DNAStar软件对测序结果进行序列拼接并分析,同源性分析发现,26株分离株之间核苷酸和推导氨基酸同源性都很高,分别为为91.1%-99.2%、93.8%-99.6%,与其他毒株同源性最低的是SDJN-3;与Shimen、HCLV、pardarborn、HEBZ等8株经典猪瘟毒株比较,核苷酸同源性为83.8%-96.2%和氨基酸同源性为88.6%-97.6%;利用MEGA6软件对26株分离株与8株已知参考毒株序列进行比较,绘制系统发生树发现,所比较的34株分离株分为2个分支,Shimen株、HCLV疫苗株与Brescia株组成一支为1群;其他毒株为一支组成2群,其中26株分离株与Parderborn、HEBZ株亲缘关系较近组成一支为2.1群,CSFV39株为2.2群,Alfort/Tueginen株与SP01株组成一支为2.3群,结果表明本研究分离的26株CSFV属于2.1亚群,是山东地区的优势毒株。