论文部分内容阅读
我们最近的研究发现,酒精抑制大鼠结肠运动,该作用是由NO介导的,但其机制不清。已有报道,酒精可引起肝实质细胞和枯否细胞中iNOS mRNA表达增高,Blanco等研究者也发现,在人工培养的星形胶质细胞中酒精刺激可通过NF-κB途径使iNOS的基因表达上调。核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）作为转录因子,广泛参与肿瘤、炎症及免疫性疾病的发病过程,参与机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和细胞凋亡以及肿瘤生长抑制等过程的信息转导。NF-κB包括NF-κB1、NF-κB2和某些癌基因蛋白（如RelA）等,通常与其抑制蛋白IκB结合,以二聚体的形式存在于胞浆中,当细胞受到外界刺激时,如病毒或细菌感染、紫外线照射、氧化应激等,IκB被迅速磷酸化,释放NF-κB使之转入胞核内,结合于特定的κB序列,启动和调节众多与免疫、炎症反应有关的基因转录。我们推测,酒精可能通过激活NF-κB、提高iNOS表达而引起了NO释放。本课题主要是对该假设进行验证。材料与方法实验选用健康雄性Wistar大鼠,实验前禁食18h。快速牺牲大鼠,制备近端结肠纵形肌肌条,在灌流肌槽中孵育并记录肌条自发收缩活动。以平滑肌肌条张力变化为指标,分别观察经PDTC（NF-κB的阻断剂）和SMT（iNOS的阻断剂）预处理后,酒精对结肠纵形肌肌条运动的影响,用Western blot技术测定胞浆中iNOS和IκB表达量,以及NF-κB在胞核中的表达量,免疫组织化学的方法定位结肠内表达iNOS的细胞,NO试剂盒测定结肠组织NO释放量。所有数据均采用均数±标准误表示,采用单因素方差分析进行统计学处理,以P＜0.05为显著性差异界值。实验结果:1.酒精(8.7×10-4M)明显抑制离体结肠纵型肌肌条的自发收缩活动。加入酒精后,记录2～4分钟,7～9分钟,12～14分钟和17～19分钟,肌条张力的R值从1降低到0.90±0.02,0.87±0.02,0.89±0.03 and 0.87±0.01。2.灌流液中分别加入PDTC(10-2M)（NF-κB的阻断剂）或SMT(10-3M)（选择性iNOS拮抗剂）后,再加入同样剂量的酒精,酒精对结肠肌条运动的抑制作用明显减弱。3.酒精(0.17×10-3M- 1.30×10-3M)上调iNOS的表达,其中以8.7×10-4M的酒精作用最明显。PDTC(10-2M)明显抑制酒精(8.7×10-4M)对iNOS的表达的上调作用。4.酒精(8.7×10-4M)增加胞核中NF-κB的表达量,但减少胞浆中IκB的表达量。PDTC逆转酒精的这种作用。5.免疫组化发现iNOS在结肠肌间神经丛中表达。6.正常大鼠结肠中NO含量为1.112±0.128μmol/g,加入酒精后20分钟,NO含量增加为7.194±0.497μmol/g（P＜0.05,n=6）,PDTC预处理后再加入酒精,结肠中NO含量降为3.267±0.314μmol/g（P＜0.05,n=6）结论:酒精抑制结肠运动的作用是通过激活NF-κB,上调iNOS表达,从而增加NO释放量引起的。