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研究目的以内质网应激信号通路为研究靶点,开展护肝片对抗结核药物导致肝胆湿热证药物性肝损伤患者治疗效果以及护肝片中主药五味子所含有的有效成分——五味子乙素对抗结核药导致的正常肝细胞损伤的保护作用的研究。探讨护肝片调控内质网应激信号通路治疗药物性肝损伤的机制。研究方法1.临床实验本研究采用回顾性的研究方法,按照治疗方法不同将纳入研究的68名抗结核药物导致肝胆湿热证药物性肝损伤的患者分为治疗组和对照组。两组患者均采用“2HRZE/4HR”方案进行抗结核治疗,对照组给予单纯多烯磷脂酰胆碱胶囊口服治疗。治疗组在对照组治疗的基础上,加用护肝片口服治疗。疗程为14天。两组治疗期间,观察两组患者:①中医证候指标改善情况,·②肝功能相关化验指标:丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、碱性磷酸酶、国际标准化比值的改善情况;③人血清内质网应激通路相关蛋白的检测指标:GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP蛋白含量变化情况。2.体外细胞实验①使用不同浓度的五味子乙素(0、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM)和利福平(0、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM)处理人正常肝 L02 细胞 48h,通过 MTT实验确定五味子乙素的保护浓度和利福平的造模浓度。选择五味子乙素50μM为细胞保护浓度,利福平200μM作为细胞造模浓度。②实验分组:对照组:L02细胞不作任何处理;利福平组:给予L02细胞200μM利福平;利福平+五味子乙素组:L02细胞给予50μM五味子乙素和200μM利福平。处理0-72h,MTT实验检测L02细胞的存活率。③200μM利福平处理L02细胞12 h、24 h和48 h,观察内质网应激通路相关蛋白和基因表达情况。④实验分组:对照组:L02细胞不作任何处理;利福平组:200μM利福平处理L02细胞48h;利福平+五味子乙素组:200μM利福平和不同浓度五味子乙素(25μM、50μM、100μM)处理L02细胞48h,采用WB、qRT-PCR、流式细胞方法分别检测各组L02细胞内质网应激通路相关蛋白、基因表达和细胞凋亡情况。⑤实验分组:对照组:L02细胞不作任何处理;利福平组:给予L02细胞200μM利福平;利福平+五味子乙素组:L02细胞给予100μM五味子乙素和200μM利福平。作用48 h后,采用免疫荧光染色方法检测上述各组L02细胞内质网应激通路相关蛋白表达。研究结果1.临床实验①治疗组与对照组相比,中医证候疗效明显优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。②治疗组与对照组相比,患者治疗前后中医症状积分改善情况明显优于对照组。③治疗组治疗1周后,与治疗前相比,ALT、ALP明显下降,差异有统计学意义,TBIL、INR与治疗前相比差异无统计学意义。结果与对照组治疗1周后相比,仅ALT改善更明显,差异有统计学意义,ALP改善无显著性差异。治疗组治疗2周后,与治疗前相比,除ALT、ALP外,TBIL水平开始下降,与治疗前相比差异有统计学意义,与对照组治疗2周后相比,TBIL改善更明显。INR改善与本组治疗前、对照组治疗2周后相比差异仍无统计学意义。④两组患者治疗前血清中内质网应激通路相关蛋白GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表达明显增加。治疗组治疗1周后,患者血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表达仅轻度下降,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组治疗2周后,患者血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表达较治疗前明显下降。而对照组患者治疗1、2周后,血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表达均未出现明显下降。治疗2周后,治疗组比较对照组,患者血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表达下降,差异有统计学意义。2.体外细胞实验①利福平+五味子乙素组,比较利福平组,L02细胞的存活率显著提高,表明五味子乙素可以减少利福平对L02细胞的损害。②利福平可以激活内质网应激通路并促进GRP78、PERK、ATF4、CHOP、ATF6、ARMET、p-IRE1 和 XBP-1 的蛋白质表达,同时,利福平促进基因GRP78、PERK、ATF4和CHOP mRNA表达水平,呈时间依赖性。③WB、qRT-PCR方法提示五味子乙素可以有效地抑制利福平激活的内质网应激通路,下调GRP78、PERK、ATF4、CHOP、ATF6、ARMET和XBP-1蛋白和基因的表达水平,且抑制作用与五味子乙素浓度呈正相关。④流式细胞术和WB方法提示五味子乙素能有效抑制利福平诱导的L02细胞凋亡,降低凋亡蛋白PARP和Cleaved caspase3的表达,且这种抑制作用与五味子乙素浓度呈正相关。⑤免疫荧光染色方法提示五味子乙素可以有效地抑制利福平激活的内质网应激通路,下调L02细胞核内GRP78、PERK、ATF6、p-IRE1和XBP-1蛋白表达水平。研究结论①护肝片可以有效改善肝胆湿热证药物性肝损伤患者中医证候。②护肝片可以有效改善肝胆湿热证药物性肝损伤患者肝功能相关指标:丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、碱性磷酸酶。③护肝片可以有效地抑制内质网应激通路相关蛋白的表达,对抗结核药物导致的药物性肝损伤起到治疗作用。④五味子乙素能够有效地提高利福平损伤的肝细胞存活率,减少细胞凋亡,同时可以下调 GRP78、PERK、ATF4、CHOP、ATF6、ARMET 和 XBP-1 的表达水平,抑制利福平激活的内质网应激通路,且抑制效果与其作用浓度呈正相关性。提示其保肝机制可能是通过抑制内质网应激通路来实现。