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在植物的许多生长发育阶段,Dof转录因子都扮演了重要的角色。植物的基因组中包括许多编码Dof蛋白的基因:拟南芥中报道的Dof转录因子家族中基因有36个;水稻中报道的Dof转录因子家族包括30个Dof基因;大豆中报道的Dof转录因子家族中基因有28个。研究表明:大豆中GmDof4和GmDof11基因的过表达能够提高转基因拟南芥种子的总脂肪含量,同时也提高了千粒重(Wang等,2007)。
CAX基因家族被证明具有可以提高植物对重金属离子抗性的潜能。研究表明:转到拟南芥中的GmCAX1基因是植物体内与Li离子等离子相关的逆向转运蛋白,它通过调节植物体内的离子平衡,从而调控植物的耐盐性(罗光佐等,2005)。
本实验将获得的pROK2-GmCAX1-GmDof11载体通过农杆菌介导的方法将GmDof11基因导入大豆中,一方面利用GmCAX1基因的耐锂性,用氯化锂作为筛选剂以替代传统的抗生素,化解了抗生素作为大豆转基因筛选剂的弊端;另一方面,选用GmDof11基因作为目的基因转入大豆中以期许提高大豆种子的总脂肪含量。此外,本研究还探讨了大豆子叶节对植物耐锂载体的敏感性,摸索了大豆遗传转化体系以提高转化率,并通过该体系将GmDof11基因导入大豆中并进行初步鉴定。
本实验获得主要结果如下:
1.转基因体系的摸索:本研究以2个大豆品种为材料,研究了种子灭菌条件,萌发条件、诱导培养基、激素浓度对大豆子叶节再生的影响,以建立一个大豆子叶节高效再生体系用于大豆的遗传转化。结果表明,大豆种子灭菌以5~7h为宜;大豆种子萌发天数对丛生芽分化有影响,以萌发5d为宜;萌发培养基加入普通琼脂,并将大豆种脐朝同一方向摆放为宜;大豆子叶节丛生芽诱导时BAP的浓度为2 mg/L、丛生芽生根时IBA浓度以1.5 mg/L为宜。
2.子叶节对氯化锂敏感性的研究结果:88-1和猴子毛这两个大豆品种褐化的临界浓度分别为1.0mM和1.4mM;氯化锂不同浓度之间、基因型之间差异显著,即试验中注意不同基因型大豆对氯化锂反应的敏感性差异;大豆子叶节分化时氯化锂临界筛选浓度88-1为1.0mM,猴子毛为1.2mM;大豆丛生芽生根时的氯化锂临界筛选浓度88-1和猴子毛分别为0.3mM和0.2mM。
3.利用植物耐锂载体,用氯化锂作为筛选剂通过农杆菌介导子叶节的方法将GmDof11转入大豆88-1中,多批次试验后得到9株大豆转化植株并进行初步检测,共获得16粒种子。