目的:目前,大肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是常见的恶性肿瘤性疾病之一,但其具体病因及发病机制仍不明确。有关报道指出多种因素如遗传背景、环境和饮食等影响了大肠癌的发病过程,其中肠道菌群结构的改变被认为与大肠癌发病风险的增加有着密切联系。有研究指出在结直肠肿瘤组织中存在大量梭杆菌属的DNA,并经过肿瘤/正常结肠组织DNA测序后得到证实。其中具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)明显增加,并且与淋巴结转移呈正相关。本研究将通过C57小鼠在体构建原位大肠癌的实验动物模型,探讨Fn影响肠道肿瘤的发生及对肠道菌群结构的影响。方法:(1)Fn黏附和侵入结肠癌上皮细胞的测定。将Fn和结肠癌细胞系HCT116细胞共培养。利用HE染色进行细菌黏附、侵入细胞。基因芯片表达筛选差异基因。(2)原位大肠癌肿瘤动物模型的建立。将8-10周龄C57小鼠随机分组,经1周的环境适应期后,根据组别不同分别给予腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)或生理盐水,注射后7天,给予Fn菌液或生理盐水灌胃,一周后再给予第二个循环。于第81天处死小鼠,将全结肠标本取材后剖开记录肿瘤的形成情况。利用HE染色进行组织学观察,鉴别肿瘤病理性质;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、环氧化酶2(COX-2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等,分析Fn对炎症因子的影响,从分子水平探求相关作用机制;(3)大肠癌动物模型肠道中菌群结构改变的检测。利用QIAamp DNA Stool试剂盒对肠腔粪便标本进行基因组DNA抽提;利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA,对各标本基因组DNA含量进行鉴定;利用ABI Gene Amp对抽提的基因组DNA进行PCR扩增,并用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物、继而荧光定量;利用Roche GS FLX 454对PCR扩增产物的16S r RNA V3可变区进行焦磷酸测序,通过SILVA数据库将所测序列进行生物信息学比对,并经Good’s覆盖率、Shannon指数、PCA、LEf Se判别分析等多种途径对各组微生物种类进行分类学和多样性的比较,以期发现肠腔菌群结构的差异性改变;(4)Fn干预下大肠癌动物模型肿瘤组织中菌群结构改变的检测及与肿瘤发生的相关实验研究。实验结束后将收集的肿瘤组织标本利用QIAamp DNA Mini试剂盒进行基因组DNA抽提,后续基因组DNA鉴定、PCR扩增、荧光定量、16S r RNA V3可变区测序和生物信息学分析均如上所述;分组比较Fn干预与对照组组织中菌群结构的差异及其与肿瘤发生情况的关系;结果:(1)Fn能黏附和侵入结肠上皮细胞,在短时间内能保持一定的黏附附和侵入量,在细胞内保持一定的活力。基因芯片筛选出差异基因,其中BIRC3和NF-k B表达明显升高。(2)实验成功建立了原位大肠癌的肿瘤动物模型。发现Fn干预下的肿瘤发生情况明显高于对照组;发现Fn组小鼠血清中的IL-6、IL-8、COX-2、TNF-α等细胞因子水平明显高于SD组,提示炎症介导了Fn促进大肠癌进展的过程;Fn组肿瘤组织PCNA、BIRC3和NF-k B水平明显高于对照组(3)Fn干预后的焦磷酸测序结果显示Fn能够导致肠道菌群结构失衡,增加大肠癌的发病风险。主成份分析(PCA)发现不同组的肠道中菌群结构存在显著差异。发现肿瘤组中硬壁菌门(Firmicutes)丰度显著增加,而拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度明显下降;对照组中未检测到梭状杆菌门(Fusobacteria),蛋白菌门(Proteobacteria)在对照组中丰度较高,但两组间无显著性差异;在属水平上,发现肿瘤组中产丁酸盐菌Roseburia属、Eubacerium属和益生菌Ruminococcus属明显减少,而潜在致病菌Fusobacterium属则显著增加。肿瘤组中拟杆菌属(Bacteroides)丰度高于对照组(2.12%vs.0.31%,p<0.001),而对照组中Lactobacillus属(60.50%vs.45.88%,p<0.001)的丰度显著高于肿瘤组。结论:细胞实验证实Fn能黏附和侵入结肠上皮细胞,促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、介导炎症过程促进肿瘤形成;通过大肠癌肿瘤动物模型发现肠道菌群结构发生了显著变化;Fn可以改变菌群结构,增加致病菌丰度,提示Fn在大肠癌发生发展中起重要的作用。另外,益生菌的应用可以降低大肠癌的发病风险。