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“三高”即高血脂、高血压和高血糖,被称为人类健康的“无形杀手”,其中高血脂不仅可导致动脉粥样硬化、脂肪肝、冠心病等心血管疾病,而且与高血压、高血糖等相关疾病关系密切,严重威胁人类健康。高脂血症主要是由血浆中甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)和类脂(lipid,LP)含量持续过高引发,其中TG影响尤为突出。TG被脂肪水解酶(简称脂肪酶,lipase)在肠粘膜细胞内水解生成甘油(甘油二酯或单酯)和脂肪酸,大量的脂肪酸在脂肪合成酶作用下,在肝脏中再次形成TG,从而引起血脂水平上升。同时,细胞代谢会产生大量自由基,而血液中过量的自由基更易通过氧化或修饰脂蛋白胆固醇,使脂质水平上升。已有研究表明,具有强自由基清除能力的抗氧化活性化合物黄酮和多酚类物质,可通过抑制TG合成过程中关键酶的催化活性,下调血清中TG水平,从而达到降血脂目的。国内外大量研究证实,桑树各部位的提取物均具有降血脂功效。其中,桑叶、桑根和桑椹的报道较多,但关于桑枝抑制脂肪酶活性的研究,特别是在脂肪酶活性跟踪下,从桑枝中分离出具有抑制脂肪酶作用的活性物质的研究鲜有报道。研究表明,逆境环境(过酸过碱、干旱胁迫等)或诱导处理(物理诱导、化学诱导、生物诱导等)会影响植物部分次生代谢产物的含量和种类,故本论文旨在对诱导处理后的桑枝进行降血脂活性研究,并在抑制脂肪酶活性跟踪下,寻找天然的脂肪酶抑制剂,以期为桑资源的开发提供理论依据,为开发降血脂药物提供新思路。具体研究内容及结果如下:1桑枝降血脂活性部分的筛选为了科学、快速定位降血脂活性萃取部分,本研究对诱导后桑枝粗提物各萃取部分进行了总多酚、总黄酮含量测定,及抑制脂肪酶、降胆固醇、清除DPPH自由基(DPPH?)清除力、保护DNA潜力等降血脂相关活性的测试,结果表明各萃取部分差异明显。桑枝粗提物的乙酸乙酯萃取部分(TEE)的多酚与黄酮总含量(247.79 mg/g)显著高于石油醚萃取部分(TPE)(57.19 mg/g)、正丁醇萃取部分(TBE)(138.20 mg/g)和剩余水相部分(TWE)(43.15 mg/g)(P<0.05);TEE(IC50为1.06±0.08 mg/mL)对脂肪酶抑制作用显著强于TPE(IC50>12.80 mg/m L)、TBE(IC50为6.39±0.98 mg/mL)和TWE(IC50为11.21±1.98 mg/mL)(P<0.05);对清除DPPH?的能力(IC50为0.24±0.01 mg/mL)也远强于TPE(IC50为0.77±0.10mg/mL)、TBE(IC50为10.35±1.12 mg/mL)和TWE(IC50为12.18±1.80 mg/m L)(P<0.05)。结果表明:TEE各降血脂相关活性均最佳。2抑制脂肪酶活性成分的分离与鉴定为了直接定位降血脂活性成分,本研究在抑制脂肪酶活性跟踪下,对TEE中具有脂肪酶抑制活性的成分进行分离鉴定。首先,基于不同填料的柱色谱(硅胶柱色谱、氧化铝柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱)及重结晶等分离手段,在薄层层析-自显影技术(TLC-自显影技术)和脂肪酶抑制活性的跟踪下,通过高通量筛选法,结合TLC-自显影技术,从TEE(85.6 g)中分离得到6个具有显著脂肪酶抑制活性的化合物。其次,基于理化性质分析结果,利用TLC、高效液相色谱(HPLC)法,将所分离得到的活性物质与标准品进行比对,应用核磁共振(NMR)、质谱(MS)进行结构数据分析。最终确定MT4~7分别为芦丁、槲皮素、桑色素、氧化白藜芦醇,MT1、MT’2结构有待进一步分析确定。3单体化合物抑制脂肪酶活性检测及活性机制初探首先,由MT1、MT’2、芦丁、槲皮素、桑色素和氧化白藜芦醇的脂肪酶抑制活性检测结果分析可知:MT’2的抑制作用最强(IC50为0.12 mg/mL),其次为槲皮素(IC50为2.04 mg/m L)、MT1(IC50为0.99 mg/mL)、芦丁(IC50为1.89 mg/mL)、桑色素(IC50为2.19 mg/m L)以及氧化白藜芦醇(IC50为13.80 mg/m L)。其次,应用AutoDock程序,采用分子对接手段,寻找槲皮素和脂肪酶合理的构象和取向,得出槲皮素与脂肪酶是通过氢键结合,即1)槲皮素5-OH的H原子与脂肪酶ASP-248的H形成氢键,距离为2.8?;2)槲皮素7-OH的H原子分别与脂肪酶ASP-332和ARG-266残基中的O形成两个氢键,键长分别为2.2?和2.3?;3)槲皮素7-OH的O原子则与脂肪酶LYS-240的H形成氢键,距离为2.4?,从而占用脂肪酶的活性位点,使酶失活。脂肪酶的活性残疾通过氢键与槲皮素结合,使其不再具有水解脂肪的能力,从而减少血液中TG的来源,下调TG水平。本实验通过多个降血脂相关活性指标评价了经诱导处理的桑枝的降血脂活性,并从分子水平探讨了分离鉴定的具有较好脂肪酶抑制活性的槲皮素与脂肪酶的作用机制。以上内容不仅为寻找天然源脂肪酶抑制剂提供了新途径,可为治疗高脂血症药物的开发提供新思路。