人类胚胎干细胞由于具有无限增殖，发育为三个胚层不同类型细胞的潜能，在再生医学和细胞替代治疗中具有重要作用。但是，最近有较多报道提示在长期传代过程中，人类胚胎干细胞可发生似于人类肿瘤发生过程中染色体和基因的改变。因此安全性问题引起了人们广泛的关注。但是到目前为止，还没有直接的证据证明这种恶性转化的过程。本研究分析了人类胚胎干细胞在长期传代过程中染色体由1号染色体简单重复致复杂核型异常的动态过程，并对这个过程中不同阶段的核型异常的人类胚胎干细胞进行了细胞生物学特征和行为的鉴定，首次报道了异常核型的人类胚胎干细胞的遗传不稳定促使人类胚胎干细胞的恶性转化，最后通过基因芯片在基因水平上对这个过程进行了分子机制的探索。从染色体水平、细胞生物学表型、基因水平系统的分析提示：异常核型的人类胚胎干细胞的恶性转化具有向肿瘤细胞、肿瘤干细胞演变的趋势。第一章异常核型人类胚胎干细胞的鉴定及细胞遗传学的分析目的：检测异常核型人类胚胎干细胞的生物学及细胞遗传学特性并探索随着传代的进行，染色体发生改变的规律。方法：对人类胚胎干细胞，在体外培养的过程中，每5-10代进行染色体的分析，通过G显代、比较基因组杂交及原位杂交技术检测并确定细胞核型。对实验采用异常核型人类胚胎干细胞株chHES₃进行三个方面的检测，胚胎干细胞的未分化特性，如胚胎干细胞表面标记，碱性磷酸酶（AKP）活性；体内外分化能力检测，如拟胚体形成能力，胚层相关基因表达，体内畸胎瘤形成等。结果：异常核型的人类胚胎干细胞染色体检测发现：在早期的变异中（P34），表现为单一的核型，核型为46，XX，dup（1）（p32pter）；传代到P44-P99时，核型日益复杂无序，出现累及多条染色体的结构重排和复杂的重排，核型为46，XX，dup（1）（p32p36）t（1；6；4）（q25；q23；p16）ins（4；1）（p16；q21q25），t（7；8）（q32；q13）；传到P114，出现四中嵌合核型，除了44-99代出现的核型外，另外三种核型分别为：46，XX，dup（1）（p32p36）t（1；6；4）（q25；q23；p16）ins（4；1）（p16；q21q25），t（7；8）（q32；q13），mar（2?）；46，XX，dup（1）（p32p36）t（1；6；4）（q25；q23；p16） ins（4；1）（p16；q21q25），t（7；8）（q32；q13），mar（2?），mar（6?），mar（12?）；47，XXX，dup（1）（p32p36）t（1；6；4）（q25；q23；p16）ins（4；1）（p16；q21q25），t（7；8）（q22；q22）。到了P142和P153的ES细胞系核型为：47，XXX，dup（1）（p32p36）t（1；6；4）（q25；q23；p16）ins（4；1）（p16；q21q25），t（7；8）（q22；q22），P188～P197代在P153代基础上X三体重新变成X二体，核型变为46，XX，dup（1）（p32p36）t（1；6；4）（q25；q23；p16）ins（4；1）（p16；q21q25），t（7；8）（q22；22），mar（157）。异常人类胚胎干细胞（chHESC₃）生物学特性均符合国际胚胎干细胞建系标准，细胞表达SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct4等胚胎干细胞的特异性标记，AKP染色呈阳性；扫描电子显微镜观察，相对正常核型的HES细胞，异常核型的HES细胞质内拥有更发达的细胞器结构；chHESC3脱离饲养层细胞后在含有血清替代物的培养基中悬浮培养能够形成拟胚体，对拟胚体进行检测发现：拟胚体表达内、中、外胚层的标志基因如AFP、tansferrin、KDR、nestin、SOX1等，而全能性相关基因nanog、oct4表达明显下调；异常核型的人类胚胎干细胞注射到SCID鼠大腿体内形成畸胎瘤，包含有来源于三个胚层的细胞。结论：正常与异常核型chHESCs-3细胞株仍保持未分化状，具有多能性；异常核型的人类胚胎干细胞具有正常人类胚胎干细胞的特征，也是一种胚胎性细胞；核型的改变符合肿瘤染色体变化的规律。第二章异常核型的人类胚胎干细胞表型特征目的：研究异常核型的人类胚胎干细胞细胞细胞生物学表型特征。方法：采用在亚优化培养条件下，观察正常核型、异常核型的人类胚胎干细胞体外培养状况；检测正常核型、异常核型人类胚胎干细胞细胞周期的分布；检测正常、异常核型人类胚胎干细胞细胞凋亡率；检测体外形成单克隆能力；检测正常核型、异常核型胚胎干细胞细胞群落中不同亚群分布；生物信息学分析单纯一号染色体重复区域与细胞增殖、细胞周期调控、肿瘤演进相关基因并进行检测。结果在亚优化培养条件下，正常核型的人类胚胎干细胞分化严重，具有很高的分化比例，但是异常核型的人类胚胎干细胞细胞在克隆的边缘或中央较容易保持未分化状态；正常核型的人类胚胎干细胞细胞周期中S期细胞的比例为34.12±0.8054％；在复杂核型异常组早期（P70—110）S期细胞所占的百分比为35.08±3.96％，G1期细胞则是52.16±8.38％。在复杂核型组晚期（P120-180），S期细胞所占的百分比是47.6±7.54％，而G1期细胞比例下降至37.2±3.09％，随着传代次数的增加，S期细胞在细胞周期中所占的比例变得越来越高。正常核型的人类胚胎干细胞凋亡率为10.27±0.45％，异常核型的人类胚胎干细胞相对正常核型的人类胚胎干细胞来说，具有更低的凋亡率；随传代的进行，异常核型的人类胚胎干细胞的凋亡率逐渐降低。单克隆形成实验来看，早期复杂核型的chHES-3（p157—163），单克隆形成率为0.034％，晚期复杂核型的chHES-3（p202—205），单克隆形成率为0.044％，单克隆形成率与细胞种植的密度、与滋养层细胞的批次相关；相对正常核型的人类胚胎干细胞，异常核型的人类胚胎干细胞具有更高的单克隆形成率。正常核型的人类胚胎干细胞中TRA-1-60（65.4％）、CD133（75.4％）的比例大于异常核型的人类胚胎干细胞的51.6％、60.4％。异常核型人类胚胎干细胞一号染色体重复区域原癌基因HKR3、LCK表达量上升。结论：异常核型的人类胚胎干细胞具有更强的保持未分化能力、具有更强的自我更新的能力、更强的抗凋亡能力；正常核型的HES细胞与异常核型的HES细胞群落中存在着明显的异质性，处在原始干细胞不同发育的阶段。第三章异常核型的人类胚胎干细胞向肿瘤演进的表型目的：比较正常核型、复杂核型人类胚胎干细胞和EC细胞致瘤的差别，评估异常核型的人类胚胎干细胞体内致瘤能力。方法：通过畸胎瘤实验模拟异常核型的人类胚胎干细胞向肿瘤演进的过程。将异常核型的人类胚胎干细胞分为三组：1)核型正常组；2)核型变异组（复杂核型）；3)畸胎癌干细胞组；取生长状态较好的人类胚胎干细胞注射入严重免疫缺陷小鼠后退肌肉内，观察肿瘤大小，监测小鼠的体重随时间的关系，10周后处死SCID鼠，制备组织切片，HE染色后光镜下观察细胞的组织形态，原始神经管样结构，并与临床的畸胎瘤标本进行比较；不同发育时间正常核型人类胚胎干细胞致畸胎瘤标本的比较；免疫组织化学法检测畸胎瘤中各分子的表达情况。结果：异常核型的人类胚胎干细胞形成的瘤组织内可见数量不等的三个胚层衍化的组织；分化程度为未成熟、欠成熟和完全成熟的瘤组织，各胚层瘤组织成份互相掺杂，可见分化成熟的骨、软骨组织、鳞状上皮、腺上皮、肝脏组织等，而分化不成熟的间叶组织及神经组织较多。不成熟的神经组织多呈神经外胚层分化，如：菊形团或小管样排列，或在神经胶质纤维的背景上瘤细胞弥漫排列，有的呈星形细胞瘤样、神经母细胞瘤样及室管膜母细胞瘤样组织等，还可见到视网膜样上皮伴黑色素沉着。整个肿瘤未成熟组织较多，属未成熟性畸胎瘤Ⅲ级；正常核型人类胚胎干细胞所致的畸胎瘤中的细胞核型没有发生改变，之所以形成未成熟畸胎瘤，与细胞发育的时间有关；正常核型与异常核型人类胚胎干细胞在10周的体内发育过程中，所形成的肿瘤都没有发生转移；异常核型人类胚胎干细胞所致的畸胎瘤与临床标本相差不大，具有很大的相似性；异常核型人类胚胎干细胞所致的未成熟畸胎瘤组织标本中，具有较多的类原始神经管样结构，这些结构内的细胞表达Oct4。结论：异常核型的人类胚胎干细胞所致的畸胎瘤为不成熟畸胎瘤Ⅲ级，瘤体内存在很多未分化完全的组织和细胞，具有干细胞的特征，具有高增殖的潜能，具有向肿瘤、肿瘤干细胞演进的趋势。第四章异常核型的人类胚胎干细胞向肿瘤演进分子机制的初步探讨目的：分析异常核型的人类胚胎干细胞向肿瘤演进的分子机制方法：收集正常核型，1号染色体重复的、复杂核型的人类胚胎干细胞及畸胎癌细胞四种样本，通过基因芯片进行基因表达谱的分析，对表达差异基因进行了染色体的定位分析和各染色体上表达率的分析，对具有表达差异的基因进行了生物学功能的分析、聚类分析及细胞信号传导的分析。结果：比较了正常核型的chHES-20（P11），1号染色体异常的chHES-3（P72），复杂核型的chHES-3（P182）和人胚胎癌细胞（NTERA-2）的基因表达谱。在芯片的20387个基因中，以上四个样本分别有12378、11001、11375和11096个基因表达，相对于其他三组来说，正常核型的人类胚胎干细胞表达较多的基因，而其他三组细胞基因表达数目相差不大。通过分析，正常核型的HES中有1176个基因特异的表达，1号染色体异常的HES中有280个基因特异表达，而复杂核型的HES中有359个基因特异表达。由于1号染色体短臂的重复是所有异常核型chHES-3细胞的共同特点，为了了解染色体的变化是否与基因的表达存在一定的关系，我们把在三个HES中表达的差异基因利用Visual inspection and initial statistical软件进行了染色体的定位分析。1号染色体异常的HES相对于正常核型而言，共有629个上调的基因，其中84个主要集中在1号染色体短臂，特别是在1p32-36区域内，占13.35％。而发现的2504个下调基因则平均分散在所有的染色体上。复杂核型的HES细胞相对于正常核型的HES细胞来说，有1285个基因上调，其中有206个基因主要集中在1号染色体上，有117个基因在1P32-36区域内，占9.1％；在全能性基因这一组，在所有样本中都表达的，18个严格意义上的全能性相关基因及候选基因中，POU5F1、SOX2、Nanog、LDB2、GABRB3、FGFR4、LEFTY2、DNMT3B、CD9这九个基因渐进性的升高。在21个外胚层发育相关的基因中，FN1、MSI2、NEDD1、SEPT2、NEFH、NEDD4、PAX6、OTX2、MCFD2、SOX3这九个基因；在28个与中胚层发育相关的基因中，EOMES、FLT1、GATA2、HLA-C、KDR、LMO2、MYL4、PECAM1，PITX2、RUNX1、T、THBS1、THBS2、VCAM1这14个基因；在七个和内胚层发育相关的基因中，AFP、CER1、FOXA2、GATA4、GATA6 and HNF4A这六个基因，它们都有下降的趋势；在正常核性、异常核性与畸胎癌细胞中，我们全面的比较了重要信号传导通路中分子的基因表达谱。在与Wnt信号传导相关的差异基因中，在1号染色体异常的HES细胞和复杂核型的HES细胞中，效应分子GSK-3beta有一个明显的下降；比较了四个样本中的Hst（FGFR1）、MDM2、BCL2、LMO2、ERBB2、TPM3、NTRK1、MET、CDK4、LMO1等10个原癌基因表达。其中ERBB2、TPM3、TPM4、FGFR1、MET和CDK4等6个基因在四个样本中都表达，如FGFR1基因卷入了FGF信号传导通路，CDK4在细胞周期方面发挥重要的作用。在抑癌基因组，PTPRG、PTCH、SMAD4、PTEN、RERE、RPL10A、TIMP、CDH1、AP、TP53、RERE、BRCA1、MSH2、NME1这十四个基因均在四个样本中表达，特别是NME1和CDH1，它们的表达水平都很高，这些基因可能在保持干细胞增殖与分化的平衡、干细胞的稳态方面发挥重要的作用。RERE、VHL、TP53、CDH1、NF1在所有正常的胚胎干细胞中表达，在EC细胞中不表达；相对与正常核型的HES细胞，一号染色体变异的HES细胞中有43个基因表达量超过了16倍，这些基因中包括HNRPD、NCAM2、GRB2、MALAT、THRAP3，他们表达量的升高赋予了细胞更高的细胞增殖能力。相对于一号染色体变异的HES细胞来说，复杂核型HES细胞中有29个基因表达量超过了16倍，在这些基因中，有CDK6，FLJ21148，DIP13B、MAD1L1、DIP13B这些基因调节了细胞周期的进行和细胞的增殖，而这些基因如NRCAM、CELSR1、CUGBP2、SMURF1，阳性调节了神经的分化，卷入了神经上皮发育的信号传导通路或中枢神经系统的发育。这些结果是以前研究中没有报道的，反映了复杂核型的HES细胞具有更强的细胞增殖能力和向神经分化的倾向；通过对正常核型与1号染色体异常的HES细胞进行对比凋亡分析，我们抽提出了34个与凋亡相关的表达差异基因。在这34个表达差异基因中，有11个基因表达上调，其中有6个基因的功能是抗凋亡和阴性调节凋亡的，其他5个基因的具体功能不祥；在23个下调的基因中，有15个基因具有诱导凋亡和阳性调节凋亡，其他8个与凋亡相关的基因，是阳性调节凋亡还是阴性调节凋亡，具体的功能不祥。总体上说，1号染色体异常的HES细胞具有更强的抗凋亡和阴性调节凋亡的能力。应用同样的方法，在复杂核型相对1号染色体异常的HES细胞中，我们抽提了31个与凋亡相关的差异基因，在11个上调的基因，有3个基因具有抗凋亡和阴性调节凋亡的能力，其他基因与凋亡相关，但是具体的功能不祥。在下调的20个基因中，有9个基因具有诱导凋亡和阳性调节凋亡的功能，4个基因具有抗凋亡的能力，但是其他基因的功能不详。结论：异常核型的chHES3通过染色体的重复增加相关基因的表达量来维持细胞的表型如1号染色体短臂的重复；也可以通过热点染色体12、17上的基因过表达来维持细胞生物学表型；复杂核型的人类胚胎干细胞还没有发展到EC细胞阶段，处在向肿瘤干细胞、肿瘤的演进阶段；异常核型的人类胚胎干细胞内Wnt、TGF-beta信号传导通路出现紊乱，它的生物学特征可能是这两条信号传导通路共同作用的结果；异常核型的人类胚胎干细胞自我更新能力增强的同时，向各胚层分化的能力减弱；异常核型的人类胚胎干细胞中原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因表达发生改变，这些基因的改变是引起细胞生物学表型的原因。课题创新性：1．首次系统地观察了人类胚胎干细胞染色体发生改变的动态过程，并在体外检测了异常核型的人类胚胎干细胞的生物学特征。首次报道了一种新的人类胚胎干细胞异常核型；首次对这种异常核型的人类胚胎干细胞进行表型进行研究。2．通过正常、异常核型人类胚胎干细胞及畸胎癌细胞体内成瘤实验，比较四者之间致瘤的差异并和临床的病理标本做比较，探寻异常核型的人类胚胎干细胞致瘤性的可能性。对人类胚胎干细胞临床应用提供了安全性评估标准。3．在体外和体外模拟了肿瘤发生的过程，建立一种肿瘤发育相关的模型，阐明肿瘤与发育之间的关系，首次提出异常核型的人类胚胎干细胞可能处于人类胚胎干细胞向肿瘤干细胞发育的一个中间阶段。4．系统地应用基因芯片分析正常与早期简单核型异常人类胚胎干细胞基因的表达谱。筛选两者之间的差异表达基因，发现一批调控人类胚胎干细胞自我更新、抑制分化的差异基因。5系统地应用基因芯片分析正常、异常人类胚胎干细胞及畸胎癌细胞基因表达谱，筛选了一些肿瘤发生相关的基因及信号传导通路。发现Wnt信号传导通路在此过程被激活，并对此通路进行了分析。开展人类胚胎干细胞致瘤性的分子机制研究。