近年来国内食品安全事故层出不穷,而食源性致病菌污染是食品安全中最常见的问题,食品中的微生物污染在国内外都是影响食品安全的最主要原因。食品的微生物检测是防止污染食品流入市场的最后一个关口,我国现有食源性致病菌国家和行业检测标准,存在技术滞后、可操作性不强、检测过程耗时费力、检测成本高等问题,无法适应现有庞大的食品生产和消费规模的市场需求。蛋白芯片是将各种蛋白质(如抗原、抗体)、多肽以及受体、配体等有序固定于某一载体(如滤膜、凝胶、玻片、纳米微珠和微孔板)之上,以分析检测样品中能与之特异相互作用的成分。现已应用于多种研究领域,如蛋白质组学、食品检验、疾病诊断、药物筛选、农林畜牧业、司法鉴定等领域,并且一些成熟的蛋白芯片产品已经推广上市。但目前蛋白芯片的样点质量控制的问题,仍然没有很简便的方法去解决。本课题首先解决的问题即是蛋白芯片样点质量控制的问题。在构建可检测大肠杆菌O157:H7的单检蛋白芯片的基础上,通过在点样缓冲液中添加丽春红染色剂的方法,使得抗体蛋白在点样后,即可通过丽春红染色的作用,对蛋白芯片检测完成后样点的圆润程度及均匀程度作一预判,从而达到蛋白芯片样点质量控制的目的。同时,利用该缓冲液对点样环境的相对湿度及点样抗体的固定条件进行优化,选出效果最佳的一组作为该蛋白芯片的点样环境的相对湿度和点样抗体固定条件。研究结果表明,通过在点样缓冲液中添加丽春红可起到对点样抗体染色的作用,并且添加在点样缓冲液中的丽春红在芯片封闭完成后即可洗脱至无色,不会影响后续的显色效果,通过实验确定了点样缓冲液中丽春红的最佳添加量为1%(w/v);通过在点样缓冲液中添加甘油可起到消除样点“咖啡环”现象的作用,使得点样抗体在NC膜上的扩散更均匀一致,同时甘油还能对点样抗体起到保湿的作用,延长芯片的有效期限,实验中确定了甘油的最佳添加量为10%(v/v);利用优化好的点样缓冲液稀释点样抗体并制成蛋白芯片,对点样环境相对湿度进行优化,并最终确定点样环境相对湿度为55%(环境温度:20±1℃);同时,还对点样抗体固定条件的选择作一优化,通过实验发现点样抗体的最佳固定条件为37℃2h。本实验还对在点样缓冲液中添加丽春红染色剂对蛋白芯片性能影响进行了评估,结果表明,无论在点样缓冲液中是否添加丽春红染色剂,对蛋白芯片的检测灵敏度、多检效果、检测特异性均没有影响。表明了在点样缓冲液中添加丽春红染色剂作为蛋白芯片一种样点质量控制的方法,并不会对芯片的检测性能指标造成影响。在此基础上,以大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、坂崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)3种食源性致病菌为检测对象,利用硝酸纤维素膜制作检测蛋白芯片,利用“HRP(辣根过氧化物酶)催化DAB(二氨基联苯胺)显色”技术,使得检测结果肉眼可见,摆脱常规蛋白芯片对大型设备的依赖,便于普通实验室使用。通过条件优化,将无交叉反应的3种食源性致病菌多克隆抗体点制在硝酸纤维素膜上,制作出只通过一个样品即可同时检测3种食源性致病菌的可视化快速联检蛋白芯片,降低目前食源性致病菌的检测工作量,提高检测效率,最终实现在2.5个小时内同步完成3种食源性致病菌的检测工作。结果表明,该联检蛋白芯片对大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度为7.1×10~5CFU/mL、对鲍氏志贺氏菌的检测灵敏度为2.2×10~5CFU/mL、对阪崎肠杆菌的检测灵敏度为2.6×106CFU/mL,可进行3种致病菌的同时检测,以及对其他33种致病菌均不会检出。最后,本课题还构建了一种可检测大肠杆菌O157:H7的抗原芯片,其采用的是“竞争”免疫检测法的原理,与“双抗夹心”免疫检测法相比,“竞争”免疫检测法所具有的优势为,实验中只需采用一种抗体即可,大大降低了芯片的生产成本。实验中,对该种芯片的检测抗体(HRP标记的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体)的工作浓度进行了优化,结果表明,该种芯片所需检测抗体的最佳工作浓度仅为1:20000,而用“双抗夹心”免疫检测法所制得的芯片所需检测抗体的最佳工作浓度为1:1000,这显然降低了检测抗体的用量,节省了实验的成本。同时,对该种抗原芯片进行检测灵敏度和特异性的验证,结果表明,该种芯片的检测灵敏度为7.2×10~5CFU/mL,并且只对大肠杆菌O157:H7可以检出。这与用“双抗夹心”免疫检测法所得的结果基本相同。最后,对市面上购买的液体牛奶(无菌)进行了人工污染的检测,结果表明,其检测灵敏度与用纯菌液所得的检测灵敏度完全相同,均为7.2×10~5CFU/mL。最终,该种抗原芯片可实现大肠杆菌O157:H7的正常检测,且该芯片因只需一种抗体,使得该种芯片可以以较低的价格在市场上进行推广使用。