研究背景胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,据世界卫生组织WHO的最新报道,虽然近年其发病率有所下降,但胃癌的死亡率在全球范围内仍居高不下,在男性死亡率中仅次于肺癌、肝癌之后,在女性死亡率中仅次于乳腺癌和肺癌之后,在所有恶性肿瘤的死亡率中位居第三位。据我国肿瘤登记中心在2014年收集的全国范围内所有恶性肿瘤的数据统计结果显示:2014年我国胃癌的发病率在所有恶性肿瘤中排在肺癌之后,即恶性肿瘤发病率的第二位;胃癌的死亡率在所有惡性肿瘤当中位于第三位,居于肺癌、肝癌之后,因此胃癌这种恶性肿瘤仍严重的威胁着全球尤其是我国人民的健康。目前胃癌的治疗手段包括:外科手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、靶向药物治疗及新近迅猛发展的免疫相关治疗等等。对于早期胃癌主要采用手术为主的治疗;而对于晚期胃癌的治疗则是以化疗为主的综合治疗,包括静脉输入或口服化疗药物,并辅以靶向治疗、放疗以及免疫治疗等等。治疗目的是控制或延缓肿瘤的生长、尽量改善肿瘤患者的症状、延长肿瘤患者的生命以及提高肿瘤患者在有限生存时间内的生活质量。虽然,近年来胃癌治疗中化学治疗的有效率取得了一定的发展和进步,但恶性肿瘤多药耐药(Multi-drug resistance,MDR)这种现象的存在常导致胃癌化学治疗的有效率较其他恶性肿瘤低。恶性肿瘤的MDR现象指的是恶性肿瘤细胞对某一种抗肿瘤药产生耐药性的同时会出现多重药物抗药性,即对其他结构不尽相同、作用靶点相异的药物同时也产生了不同程度耐药性的这种现象。恶性肿瘤的多药耐药性根据产生原因的不同可分为先天性多药耐药、获得性多药耐药两种。先天性耐药是指恶性肿瘤细胞先天固有的对抗肿瘤药物不敏感的特性;获得性耐药是指肿瘤细胞在某些外在因素的作用下,如药物或其他的因素作用下产生的对药物的耐药性。胃癌就属于MDR表型比较强的恶性肿瘤之一,这也是导致目前胃癌治疗中化疗有效率低于50%的重要原因之一,进展期胃癌5年的生存率低于30%也与之有着密切的关系。因此,针对胃癌目前的治疗现状,增强和重建胃癌细胞对化疗的敏感性以提高其化疗的疗效是当前研究的热点之一,其对提高胃癌病人的生存率及延长患者的生命具有重要的现实意义。目前在研的各种肿瘤MDR逆转化剂或增敏剂在体内达到发挥作用的有效浓度时,通常其剂量较大,因而不良反应较明显,从而限制了其在临床上的应用。因此进一步研发有效的、低毒的化疗药物增敏剂或逆转剂具有明显的临床实际应用价值。中草药通常不仅药理作用比较广泛,而且副作用又比较小,因此从中筛选新型的MDR逆转剂是很有前景的。小白菊内酯(parthenolide,PN)是一种从菊科植物草药野甘菊和艾菊中提取的主要活性成分,是一种天然的倍半萜烯内酯化合物单体。传统上的小白菊主要用于发热、类风湿关节炎和偏头痛及牙痛等疾病的治疗。近些年来国内、国外研究发现小白菊内酯也具有抗肿瘤作用。研究资料表明小白菊内酯不仅在体外实验中具有明显的抗肿瘤活性,能够抑制包括大肠癌、乳腺癌、胸腺癌、胰腺癌、胆管癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌等多种肿瘤细胞的生长,并促进其凋亡;同样在体内实验中也显示小白菊内酯有抗肿瘤作用,如在乳腺癌移植瘤动物模型中可延长动物的存活时间及存活率。目前的研究显示小白菊内酯抗肿瘤的机制包括抑制核转录因子-κ B(NF-κ B)、诱发活性氧(R0S)、活化c-Jun氨基端激酶(JNK)、抑制STATs活性、调节DNA甲基化作用及促进MDM2(murine double minute2)的泛素化等等。近年来的研究还发现小白菊内酿还能增强某些肿瘤对化疗的敏感性,包括乳腺癌、非小细胞肺癌、大肠癌、肝癌和恶性黑色素瘤等多种肿瘤。但目前在此领域的相关机制尚十分不明确。本研究以胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP为研究对象,观察应用小白菊内酯后该细胞对顺铂药物的敏感性的变化并进一步探讨其可能机制,为其应用于临床提供理论基础。目的观察小白菊内酯(parthenolide,PN)对人胃癌细胞株SGC-7901/DDP的增殖抑制作用、促凋亡作用、细胞周期阻滞作用及小白菊内酯与化疗药物之间的相互作用,并探讨其对相关蛋白的影响等抗肿瘤机制。方法1.采用MTT法检测小白菊内酯对胃癌耐药细胞的增殖抑制作用及小白菊内酯和顺铂的联合作用。首先,筛选合适的小白菊内酯药物处理浓度,用不同浓度的小白菊内酷(Oμmol/l,2.5μmol/l,5μmol/l,10μmol/l,12.5μmol/l,15μmol/l)分别处理SGC-7901/DDP细胞,在24h、48h、72h时分别用MTT法检测增殖抑制率,筛选得到的合适的小白菊内酯浓度为:5μmol/1和10μmol/1。同时为了进一步观察小白菊内酯处理后细胞对药物敏感性的变化,进一步筛选顺铂的合适浓度,顺铂按以下浓度(0μg/ml,1.25μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,l0μg/ml,15μg/ml)分别处理SGC-7901/DDP细胞,并分别于24h、48h、72h时进行MTT测,筛选出顺铂的合适浓度为1.25μg/ml和2.5μg/ml。根据筛选结果:分别以5μmol/l、10μmol/l小白菊内酯和1.20μg/ml、2.5μg/ml顺铂联合,即以①5μmol/l小白菊内酯+1.25μg/ml顺铂,②5μmol/l小白菊内酯+2.5μg/ml顺铂、③10μmol/l小白菊内酿+1.25μg/ml顺铂、④l0μmol/l小白菊内酯+2.5μg/ml顺铂分别处理SGC-7901/DDP细胞,24h后再行MTT检测联合抑制率。再将两药联合处理的抑制率EAB、单独应用A药的抑制率EA以及单独应用B药的抑制率EB,分别代入金正均法公式,q=EAB/EA+EB-EA×EB,判断两药联合作用是否有协同性。当q<0.85时为两药存在相互拮抗作用,q在0.85～1.15之间时为两药作用效果只是单纯相加,q>1.15时两药具有协同作用。2.采用流式细胞仪检测SGC-7901/DDP细胞在小白菊内酯处理后细胞周期的变化。SGC-7901/DDP细胞在含有不同浓度PN的培养基处理48h后,用Annexin V-FITC检测试剂盒染色并采用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。3.采用流式细胞仪检测小白菊内酯对SGC-7901/DDP凋亡的影响。不同浓度的小白菊内酯处理SGC-7901/DDP细胞48h后,用Annexin V-FITC/PI检测试剂盒处理,最后应用流式细胞仪检测凋亡情况。4.采用DAPI染色检测小白菊内酯对SGC-7901/DDP凋亡的影响。不同浓度的PN处理SGC-7901/DDP细胞48h后,用DAPI染色,荧光显微镜下检测SGC-7901/DDP细胞的凋亡情况。5.采用Western blot法检测小白菊内酯对相关蛋白Bax、Bcl-2、Bcl-xl、P53、Caspase-3、Capase-9、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、CylinD1、P21、Stat3、P-stat3表达的影响;不同浓度的PN处理SGC-7901/DDP细胞48h后,收集细胞,提取细胞总蛋白并进一步行蛋白定量。10%SDS-PAGE电泳分离蛋白,转印,然后分别加入 Bax、Bcl-2、Bcl-xl、P53、Caspase-3、Capase-9、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、CylinD1、P21、Stat3、P-stat3 抗体,最后加ECL发光液,上ECL发光仪检测,Image软件进行定量分析。6.采用划痕实验检测小白菊内酯作用SGC-7901/DDP后迁移能力的变化。用不含血清的不同浓度的PN处理SGC-7901/DDP细胞,分别于24h、48h和72h时拍照,测量划痕宽度的变化,并计算迁移率,迁移率=迁移距离/划痕宽度×100%。7.采用Transwell小室检测PN对胃癌SGC-7901/DDP细胞侵袭能力的作用。不同浓度的PN处理SGC-7901/DDP细胞48h后,进行结晶紫染色,计数穿过Transwell小室的细胞数。结果1.小白菊内酯对SGC-7901/DDP细胞的增殖有明显抑制作用,且增殖抑制作用随时间延长及浓度增大而提高。当PN和DDP联合时,二者之间的增殖抑制作用存在协同作用。2.SGC-7901/DDP细胞经不同浓度的小白菊内酯作用48h后,流式细胞仪检测结果显示S期和G2/M期细胞所占比例减少,G0/G1期细胞所占比例增多,差异有统计学意义(P<0.05)。3.SGC-7901/DDP细胞经不同浓度的小白菊内酯作用48h后,流式细胞仪检测结果显示PN处理48h时早期凋亡所占比例明显增加,与0μmol/l组比较差异具有显著性(P<0.05)。4.DAPI染色结果也显示小白菊内酯作用48h后,SGC-7901/DDP细胞出现明显的凋亡现象,并且随着浓度的增加出现凋亡现象的细胞增多。与0μmol/l组比较有显著性差异(P<0.05)。5.不同浓度的小白菊内酯处理SGC-7901/DDP细胞48h后,Western-blot法检测 Bax、Bcl-2、Bel-x1、Caspase-3、Cleaved caspase-3、P53、Caspase-9、Cleavedcaspase-9、P21、CyclinDl、Stat3、P-Stast3 蛋白的表达情况,结果显示:凋亡相关蛋白Bax、P53表达呈上调趋势,Bcl-xl和Bcl-2表达呈下调趋势,Caspase-3活化片段、Capase-9活化片段增多,并且随着浓度增加上述趋势更加明显;周期相关蛋白:CylinD1表达下降,P21表达升高;同时P-stat3活化明显被抑制。6.划痕实验结果显示:小白菊内酯能明显降低SGC-7901/DDP细胞的迁移能力。7.Transwell小室实验结果示:小白菊内酯能明显降低SGC-7901/DDP细胞的侵袭能力。结论综上,本研究结果显示小白菊内酯对SGC-7901/DDP细胞的增殖具有显著的抑制作用,抑制作用呈现时间-浓度依赖性,且通过金正均法判定小白菊内酯能够协同顺铀的抗SGC-7901/DDP耐药细胞增殖作用,即增强顺铂的抗肿瘤作用。进一步应用流式细胞仪及DAPI染色法证实小白菊内酯能明显诱导SGC-7901/DDP细胞出现凋亡,且在48h时以早期凋亡为主;并能阻滞SGC-7901/DDP细胞在G1期。Western-blot法检测显示小白菊内酯的抗肿瘤作用与其上调凋亡相关蛋白P53、Bax表达,下调Bel-2、Bcl-xl表达,活化Capase-9和Caspase-3,从而激活凋亡途径有关;也与下调CylinDl表达,上调P21表达,从而阻滞肿瘤细胞在G1期有关;还与抑制Stat3活化有关。此外,划痕实验和Transwell实验还显示小白菊内酯也可以明显降低SGC7901/DDP细胞的迁移以及侵袭能力。