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研究背景及目的:光老化是紫外线长期刺激皮肤,经过复杂的生物学机制造成皮肤的慢性损伤。光老化会引起皮肤抗氧化功能异常,屏障功能受损,出现组织学异常等问题。长期紫外线辐射引起的皮肤光老化表现为皮肤色泽灰暗、不规则色素沉着、皮肤粗糙、松弛、失去弹性。在组织学上可见皮肤尤其是真皮萎缩、变薄。这与紫外线辐射对皮肤的急性效应表现明显不同。急性紫外线辐射后,出现炎症和红斑为主的早期反应,并引起皮肤的真皮、表皮尤其是角质层的增厚。紫外线对皮肤急性效应和慢性效应的不同表现提示我们紫外线急慢性损伤的机制可能存在较大差异。皮肤光老化不仅表现出皱纹、色斑,造成美学上的不良感观,还造成了皮肤屏障功能下降以及防御机制的紊乱,甚至可能引起皮肤良性、恶性肿瘤,给健康带来非常不利的影响。目前预防以及治疗光老化的手段繁多,包括涂抹防晒霜、抗氧化产品、局部使用维生素A衍生物、光电疗法,注射填充等。近年来,许多研究发现光动力疗法是一种有效治疗光老化,改善皮肤状况的治疗方法,但是对其治疗光老化的机制尚不明确。光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)是在光敏剂的介导下,用特定波长的光照射靶细胞,产生氧自由基、单态氧等活性氧物质(rective oxygen specise,ROS)促发氧化应激反应从而达到治疗目的的疗法。目前光动力疗法已经成功用于治疗肿瘤、尖锐湿疣、痤疮等疾病。高浓度、大剂量的光动力疗法能通过光敏剂在增生活跃的靶组织富集,在光的激活作用下在细胞内产生大量活性氧化物,高浓度的ROS具有细胞毒性,使肿瘤细胞以及被病毒感染的细胞发生死亡从而达到治疗肿瘤和病毒疣的作用。临床上使用低浓度、低剂量光动力疗法治疗痤疮,取得非常满意的疗效,同时研究者发现PDT治疗痤疮后,皮肤的色泽和细腻度都得到了改善,推测这可能与低浓度ROS激发细胞产生应激反应,激活转录因子,调节细胞的增殖分化,启动重塑和再生过程相关。因此,人们意识到低剂量光动力治疗具有使皮肤年轻化的作用,但具体的机制还需要进一步探索。既往研究显示,低剂量光动力处理裸鼠皮肤后,鼠真皮内炎性细胞浸润明显减少,I型、III型前胶原蛋白的表达明显增加,真皮基质金属蛋白酶(Matrix metalloproleinase,MMP)-1,MMP-3,MMP-12表达下调,而表皮中TGF-β和TGF-βII型受体也有增加。经过光动力治疗后,皮肤屏障功能恢复、抗氧化能力增强、真皮组织增厚,皮肤呈现年轻化状态。有研究表明,皮肤组织中核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是调节氧化应激反应的关键因子之一。Nrf2是一种核转录因子,静息状态下与KEAP1(Kelch-like ECH-associated protein1)结合,当其受到激动后,与KEAP1解离并进入细胞核内,与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合,调控如谷胱甘肽硫基转移酶(glutathione-S-transferses,GSTs)等一系列酶参与氧化应激反应。Nrf2/ARE被认为参与了组织紫外线损伤得防御机制,我们也推测Nrf2相关通路可能也在低剂量光动力治疗光老化中起到重要作用。5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid,ALA)是目前皮肤科最常用的光敏剂,本研究也使用它作为光敏剂,探讨5-氨基酮戊酸介导的光动力疗法(Photodynamic therapy mediated by 5-amino-ketovalerate,ALA-PDT)对光老化的作用机制。我们实验室通过建立体外成纤维细胞光老化细胞模型,经低剂量ALA-PDT处理及沉默Nrf2基因表达等实验,验证了Nrf2确实在低剂量光动力治疗中起到了重要作用,但是对低剂量ALA-PDT如何激动Nrf2,使其与KEAP1分离入核调控下游转录因子的机制尚不清楚。本文通过比较正常的成纤维细胞,光老化成纤维细胞以及经低剂量光动力处理后的光老化成纤维细胞的基因表达变化,探讨低剂量PDT激活Nrf2的上游通路,达到皮肤年轻化的治疗效果。方法1.分离、培养包皮来源人成纤维细胞,并以UVA处理细胞,制作光老化成纤维细胞模型;2.分别以高剂量以及低剂量ALA-PDT处理成纤维细胞;3.使用β-半乳糖苷酶(sensecence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)染色试剂盒检测未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导光老化成纤维细胞、经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞以及高剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞;倒置显微镜检测各组细胞中的衰老细胞比例;4.使用CellTiter-Lumi?发光法检测未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导光老化成纤维细胞、经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞以及高剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞的细胞活力变化;5.按照方法1-2,制备未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导光老化成纤维细胞以及经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞;并用trizol提取细胞核酸,做转录组测序检测;6.根据转录组测序结果分析未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导光老化成纤维细胞以及经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞三组细胞的基因表达差异;7.提取未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导光老化成纤维细胞以及经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞的总蛋白,通过免疫印迹法(Western blot,WB)检测三组细胞中蛋白表达的变化;8.通过细胞免疫荧光染色检测三组细胞中p-ERK蛋白的荧光强度;9.使用不同时程的UVA诱导处理成纤维细胞,提取经不同累积时间UVA诱导的成纤维细胞的总蛋白,进行免疫印迹法检测不同时长UVA处理下细胞中p-ERK等蛋白表达的变化情况;10.使用p-ERK抑制剂与低剂量ALA-PDT共处理光老化纤维细胞;11.使用β-半乳糖苷酶(sensecence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)染色试剂盒检测UVA诱导光老化成纤维细胞、经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞和使用p-ERK抑制剂与低剂量ALA-PDT同处理光老化成纤维细胞中衰老细胞的比例;12.提取未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导的光老化成纤维细胞、经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞以及使用p-ERK抑制剂与低剂量ALA-PDT共处理光老化纤维细胞的总蛋白,通过免疫印迹法检测四组细胞中蛋白表达的变化情况。结果:1.在既往建立的光老化细胞模型上验证了低剂量ALA-PDT的治疗效果。SA-β-Gal染色的结果示经UVA诱导后,成纤维细胞中衰老细胞比例明显上升,细胞活力明显受到抑制;低剂量光动力处理后,光老化成纤维细胞中衰老细胞的阳性率下降;2.根据转录组测序的结果可知在基因表达水平相似度上,经ALA-PDT处理后,光老化的成纤维细胞的基因转录趋近于未光老化的正常成纤维细胞水平。经UVA诱导光老化后,转录水平发生改变的基因中有52个与MAPK密切相关的基因经低剂量ALA-PDT处理后转录水平恢复到正常成纤维细胞水平;3.经UVA诱导光老化后,Nrf2以及p-ERK出现蛋白水平下调,而经ALA-PDT处理后,光老化的成纤维细胞中Nrf2以及p-ERK蛋白水平显著上调,二者的变化趋势具有一致性;而p-P38在低剂量光动力处理后,均出现表达下调;p-JNK则变化不明显;4.免疫荧光染色结果与WB结果一致。相比正常的成纤维细胞,光老化成纤维细胞p-ERK荧光强度低,而经ALA-PDT处理后,荧光强度显著增加;5.在UVA诱导的初期,成纤维细胞中Nrf2以及p-ERK的表达均明显上调,而随着接受UVA处理的时间增加后,Nrf2以及p-ERK的表达逐渐受到了抑制,蛋白水平逐渐降低;6.SA-β-Gal染色结果示:低剂量ALA-PDT处理能降低光老化成纤维细胞蓝染衰老细胞的比例,ERK抑制剂与ALA-PDT同处理光老化成纤维细胞后衰老细胞的比例下降不明显;7.当UVA诱导光老化后,COL1和COL3的合成显著降低;低剂量ALA-PDT处理处理后,COL1和COL3的合成增加;ERK抑制剂与低剂量ALA-PDT同处理光老化成纤维细胞后COL1、COL3以及Nrf2表达未上调。结论:1.在体外光老化成纤维细胞模型中,采用0.1mM ALA 21J/cm~2红光的低剂量ALA-PDT处理能有效治疗成纤维细胞的光老化;2.通过转录组测序,发现MAPK相关基因参与了UVA诱导的光老化以及低剂量ALA-PDT治疗光老化的机制;3.在急性光损伤中,UVA能刺激Nrf2以及p-ERK等表达上调;而慢性光老化中,随着UVA累积作用时间和剂量的增加,导致细胞抗氧化功能障碍,增殖受到抑制,Nrf2以及p-ERK的表达水平下调;4.当抑制了ERK时,低剂量ALA-PDT不能上调Nrf2,亦不能改善成纤维细胞光老化;提示低剂量ALA-PDT可能通过上调ERK/MAPK,引起对Nrf2等下游通路的调控,治疗光老化成纤维细胞。