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目的研究表明,七氟醚预先给药能保护心肌冠状动脉血管功能,保持血管对内皮依赖和非内皮依赖血管扩张剂的良好反应性,改善缺血再灌注心肌的血流供应,对心肌缺血再灌注损伤起保护作用。七氟醚的上述作用可能与它激活线粒体KATP通道,保护血管内皮细胞和平滑肌细胞免受炎性细胞因子、自由基等损伤有关;还可通过改变线粒体膜电位影响中枢神经系统内线粒体功能,激活线粒体信号通路进行脑保护。长时程增强（Long-term potentiation,LTP）是研究与学习记忆相关的神经突触可塑性的经典指标。研究报道中枢神经系统内炎性细胞因子的升高参与应激伴随的认知功能损害过程。本研究拟通过测定七氟醚预先给药后急性心肌缺血再灌注损伤大鼠海马LTP及海马内TNF-αmRNA和IL-1βmRNA及其相应蛋白表达的变化来进一步探讨急性心肌缺血再灌注损伤对认知功能的影响及作用机制。实验材料1、实验动物健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,体重300～350g,中国医科大学实验动物中心提供。2、实验试剂戊巴比妥钠（上海化学试剂采购供应站）;Trizol（Invitrogen,美国）;One stepRT-PCR试剂盒（Promega,美国）;聚偏二氟乙烯（PVDF）蛋白印迹膜（Bio-Rad,美国）;PBS等其它试剂为国产分析纯;逆转录酶、PCR所需酶和其他试剂（Takara公司,日本）;LDH和CK试剂盒（南京建成生物工程研究所）。3、主要实验仪器:（1）小型动物呼吸机（Harvard638型,美国）（2）超低温冰箱（SANYO MDF-U,日本）（3）RM-6200多导生理记录仪（光电,日本）（4）水平板电泳系统（BIO-RAD Sub-cell GT,美国）（5）通用电泳仪（BIO-RAD PowerPac200,美国）（6）台式低温高速冷冻离心机（Sigma 3K30,美国）（7）压力换能器（Edwards LifeSciences,美国）（8）倒置显微镜（OLYMPUS AX70,日本）（9）水平摇床（GFL,美国）（10）显微图像分析系统（Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph,日本）（11）电热恒温鼓风干燥箱（余姚TDW,中国）（12）自动电泳凝胶成像分析仪（Alphainnotech ChemiImager 5500,美国）（13）小型垂直电泳仪（Bio-Rad Mini-ProteinⅢ,美国）（14）半干转印仪（Bio-Rad Seimidry transfer system,美国）（15）自动封膜仪（江苏仪器设备公司,中国）（16）HEIDOLPH DIAX900型匀浆机（德国）（17）PTC-100型PCR扩增仪（美国）（18）FACS Calibur流式细胞仪（BD,美国）（19）GLS-700D型数码凝胶扫描分析系统（上海,中国）（20）A-200 Ds电子天平（美国）（21）B-Brown微量泵（德国）（22）超纯水装置（MILLIPORE MILLI-Q,美国）（23）实验室制冰机（ZIGERA 2BE-70-35,德国）（24）恒温振荡培养箱（GFL,德国）（25）小型台式离心机（SIGMA 1-13,美国）（26）PH计（WTW InoLab,德国）（27）电动高压消毒锅（HIRAYAMA HVE-50,美国）（28）HSS-1数字超级恒温浴槽（成都仪器厂,中国）（29）倒置相差显微镜（OLYMPUS,日本）（30）JUNG-CM1800型切片机（上海）（31）Ohmeda7000型麻醉机（Ohmeda,美国）（32）VITRO1250血液生化自动分析仪（美国）实验方法1、七氟醚预先给药对急性心肌缺血再灌注损伤大鼠海马LTP的影响建立急性心肌缺血再灌注损伤大鼠动物模型,分别在结扎LV前即刻（T1）、缺血30min即刻（T2）及LV松开再灌注120min即刻（T3）3个时间点抽取股静脉血2ml,测定,离心血清CK和LDH浓度。Wistar大鼠60只,随机分为:对照组（A组）、假手术组（B组）、急性心肌缺血再灌注组（C组）和七氟醚预先给药组（D组）。七氟醚预先给药组,将大鼠放入25cm×18cm×18cm小盒内,吸入1.0MAC七氟醚60min后制备动物模型。B、C、D组手术后1、3、7d进行LTP测试分为B1、B3、B7亚组、C1、C3、C7亚组和D1、3、7亚组,每亚组6只。B组大鼠仅挂线不结扎左冠状动脉。在不同的时间点测定LTP。2、七氟醚预先给药对急性心肌缺血再灌注损伤大鼠脑认知功能影响的机制研究Wistar大鼠78只,随机分为:对照组（A组）、假手术组（B组）、急性心肌缺血再灌注组（C组）、七氟醚预先给药组（D组）和5-羟喹酸组（E组）。B、C、D组LTP测定后立即断头冰上取海马,标本液氮速冻后置-80℃低温冰箱待测,其中3只用于测定mRNA,3只用于测定蛋白表达。RT-PCR测定海马HO-1mRNA、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA;Western blot测定海马内TNF-α、IL-1β蛋白。结果与A组相比,C、D组CK和LDH浓度增高（P＜0.05）;与C组相比,D组CK和LDH浓度降低（P＜0.05）。与A、B1组相比,C1、D1组TNF-αmRNA和IL-1β表达增多,HO-1-mRNA水平升高;与C1组相比,D1组TNF-αmRNA和IL-1β表达减少,HO-1-mRNA水平降低（P＜0.05）;与C1组相比,E1组TNF-αmRNA和IL-1β表达增多,HO-1-mRNA水平增高（P＜0.05）,其余各组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。C1、D1组IL-1βmRNA表达比A、B1组明显增多（P＜0.01）。C3、D3组表达多于A、B3组。与C1、3、7组相比,D1、3、7组IL-1βmRNA表达均降低（P＜0.05）。与C1、3、7组相比,E1、3、7组IL-1βmRNA表达均增多（P＜0.05）。与A、B1和B3组相比,C1、3和D1、3组LTP受到抑制（P＜0.05）。与C1、3组相比,D1、3组LTP差异无统计学意义（P＞0.05）。讨论结扎左冠状动脉前降支是建立急性心肌缺血再灌注模型的经典方法,收紧结扎线后心电图I导联ST-T抬高,放松后抬高的ST-T降低1/2以上证明产生心肌缺血。缺血30分钟后剪断丝线,心肌颜色明显改变且出现再灌注心律失常证明心肌灌注恢复。本实验大鼠血清CK及LDH含量显著增高,表明急性心肌缺血再灌注损伤大鼠模型建立成功。预实验表明大鼠吸入1.0MAC七氟醚时自主呼吸不受抑制,血液动力学维持稳定,Obal D等研究报道与本实验结果一致。在中枢神经系统内海马是研究认知功能的经典脑区。应激反应中,海马是最易受损的脑区,其病理生理变化是认知功能改变的物质基础。以往动物实验多采用Moris水迷宫或Y—迷宫等工具测试认知功能变化。本实验动物经历急性心肌缺血再灌注后体力恢复差,无法进行迷宫测试。LTP是研究与学习记忆相关的神经突触可塑性的经典指标,本实验通过活体测定LTP从突触水平评定大鼠认知功能情况。本实验急性心肌缺血再灌注损伤大鼠海马内HO-1表达明显增强说明急性心肌缺血再灌注损伤所致氧化应激反应可对海马产生影响。大鼠1、3dLTP受到抑制,7d时与对照组已无差异,说明大鼠急性心肌缺血再灌注后发生了短暂的认知功能改变;海马内炎性细胞因子TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达增多,在蛋白翻译水平IL-1β的表达增多。且大鼠海马TNF-αmRNA、IL-1βmRNA和IL-1β表达与LTP变化在时间上吻合,推测海马内炎性细胞因子表达增多与急性心肌缺血再灌注损伤大鼠短暂的认知功能改变有关。结论1、急性心肌缺血再灌注损伤可引起短暂的认知功能改变。2、急性心肌缺血再灌注损伤引起短暂的认知功能改变,与海马内TNF-αmRNA、IL-1βmRNA升高和IL-1β蛋白表达增多有关。3、七氟醚对急性心肌缺血再灌注损伤有保护作用。4、七氟醚通过减轻急性心肌缺血再灌注损伤,使海马内TNF-αmRNA、IL-1βmRNA降低和IL-1β蛋白表达减少从而减轻认知功能的改变。