第一部分细胞因子激活的记忆样供体NK细胞在异基因造血干细胞移植后移植物抗白血病中的作用与机制目的:体外实验筛选诱导记忆样NK细胞的细胞因子组合,并验证细胞因子刺激的NK细胞的记忆样细胞表型;体内实验检测细胞因子激活的记忆样供体NK细胞在异基因造血干细胞移植后发挥的移植物抗白血病作用及机制。方法:在体外实验中,培养小鼠骨髓来源的NK细胞,体外加细胞因子IL-12、IL-15、IL-18单独或两两联合或三者联合刺激NK细胞16小时,并以IL-2刺激的NK细胞作为对照,流式胞膜染色检测细胞因子体外刺激的NK细胞纯度、活化成熟表型,胞内染色检测细胞因子的分泌情况,细胞毒实验及流式染色检测NK细胞对肿瘤细胞体外杀伤水平,并通过体外细胞因子的再次刺激实验检测记忆样NK细胞的记忆能力。以BALB/c(H2Kd)小鼠为受体鼠,经清髓辐照后,过继输注C57BL/6(H2Kb)小鼠的骨髓细胞建立异基因造血干细胞移植模型,于移植当天,过继输注小鼠B细胞淋巴瘤A20(H2Kd)细胞或A20-luc稳转细胞构建小鼠白血病模型,并于移植当天、移植后第7天或移植后第14天输注异基因(CD45.1背景的C57BL/6小鼠H2Kb)来源的体外培养的记忆样NK细胞以及对照NK细胞,观察小鼠生存状况、记录小鼠体重变化并通过小动物活体成像系统监测受体鼠的疾病进展,评价记忆样供体NK细胞在移植物抗白血病中的作用。流式检测移植后过继输注的供体NK细胞在受体鼠体内的活化成熟状态、增殖活性、凋亡水平以及受体鼠内免疫细胞表型,探寻记忆样供体NK细胞在移植物抗白血病中的作用机制。并对以上实验结果进行统计学分析。结果:(1)各细胞因子组合的激活培养对NK细胞纯度没有影响,NK细胞纯度均高于95%,本实验中体外培养的NK细胞高表达成熟分子CD43,IL-12/18以及IL-12/15/18联合刺激培养的NK细胞,其CD11b的表达显著高于对照NK细胞。IL-12/18以及IL-12/15/18刺激培养的NK细胞与对照NK细胞相比,其表面活化分子NKG2D的表达水平降低,而NKp46的表达水平略有升高,细胞因子IL-12/18以及IL-12/15/18刺激培养的NK细胞表面CD25的表达水平明显高于对照NK细胞;IL-12/18以及IL-12/15/18对NK细胞分泌的Granzyme B、Perforin的水平没有影响,与对照相比,IL-12/18以及IL-12/15/18显著增强了NK细胞的IFN-γ的分泌水平;(2)于初次刺激后第四天,用细胞因子IL-12/15再次刺激NK细胞,发现IL-12/18和IL-12/15/18刺激的NK细胞纯度略高于对照NK细胞,并且其CD11b、NKG2D、NKp46、CD25的表达水平明显高于对照NK细胞,IL-12/18和IL-12/15/18刺激的NK细胞再次经IL-12/15刺激后,其IFN-γ的分泌水平显著高于对照NK细胞;初次刺激后第8天,IL-12/18和IL-12/15/18刺激的NK细胞CD25、IFN-γ的表达水平显著高于对照NK细胞,IL-12/15/18刺激的NK细胞其Granzyme B的分泌水平也显著高于对照NK细胞。当第8天用细胞因子再次刺激时,发现IL-12/18和IL-12/15/18激活的NK细胞显著提高了IFN-γ的分泌水平。(3)体内实验中,输注一次供体NK细胞后第15天的活体成像结果显示IL-12/15/18刺激的NK细胞对白血病的发展发挥显著的抑制作用;(4)IL-12/18、IL-12/15/18激活的记忆样NK细胞在体内的活化成熟表型优于对照NK细胞,其Granzyme B、Perforin、IFN-γ的分泌水平在各个靶器官中也得以维持,但是代表其杀伤能力的CD107a的分泌与对照NK相比没有差异;在各个靶器官中,细胞因子激活的记忆样NK细胞在体内的增殖水平高于对照NK细胞,并且其早期凋亡细胞所占百分比低于对照细胞,细胞因子IL-12/18、IL-12/15/18激活的记忆样NK细胞在体内各靶器官中所占的百分比以及绝对数目都要高于传统培养的对照NK细胞;(5)此外输注IL-12/18、IL-12/15/18诱导的NK细胞后,脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞以及肝脏中CD8+T细胞分泌的TNF-α的水平明显升高,表明其增强了T细胞的抗肿瘤效应。结论:IL-12/18、IL-12/15/18的细胞因子组合可以激活免疫表型为CD43hiCD11bhiCD25hiIFN-γhi的记忆样NK细胞,并且该记忆样NK细胞可以在体内维持良好的活化成熟表型及效应因子的分泌,但不影响NK细胞在体内外对肿瘤细胞的直接杀伤水平。过继输注IL-12/18、IL-12/15/18诱导的免疫记忆样NK细胞通过在体内强大的增殖及存活能力以及对脾脏、肝脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞分泌TNF-α的水平的增强,从而在异基因造血干细胞移植后发挥显著的抗白血病效应。第二部分细胞因子激活的记忆样供体NK细胞在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病中的作用与机制目的:研究IL-12/18、IL-12/15/18激活的记忆样供体NK细胞在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病中的作用与机制。方法:本实验中构建了两种急性移植物抗宿主病模型,一种是模型对照鼠于一周左右全部死亡的超急性移植物抗宿主病模型;另一种是模型对照鼠于40天左右全部死亡的普通急性移植物抗宿主病模型。以BALB/c(H2Kd)小鼠为受体鼠,在超急性移植物抗宿主病模型中,受体鼠经致死剂量辐照一次以达到清髓效果,过继输注C57BL/6(H2Kb)小鼠的骨髓细胞和脾细胞构建超急性移植物抗宿主病小鼠模型,在普通急性移植物抗宿主病模型中,受体鼠经两次辐照(间隔4小时)以达到清髓效果,然后再输注C57BL/6(H2Kb)小鼠的骨髓细胞和脾细胞。为研究IL-12/18、IL-12/15/18激活的记忆样NK细胞在移植物抗宿主病中的作用,尾静脉注射等量的对照NK细胞、IL-12/18或IL-12/15/18激活的记忆样NK细胞,观察小鼠生存并对小鼠症状进行评分。为研究IL-12/18、IL-12/15/18激活的NK细胞在急性移植物抗宿主病中的作用机制,于移植后第4天,取小鼠脾脏、肝脏、肺脏和小肠等靶器官的淋巴细胞,流式染色检测各靶器官中淋巴细胞免疫表型;于移植后第14天,取受体鼠脾脏淋巴细胞,通过混合淋巴细胞反应实验检测细胞因子体外刺激的供体NK细胞对T细胞异基因反应的影响。并对以上实验结果进行统计学分析。结果:(1)较为缓和的急性移植物抗宿主病模型中,于移植当天单次输注供体NK细胞时,IL-12/18体外刺激的NK细胞与对照NK细胞与未输注NK细胞的模型对照鼠相比,能够明显减缓疾病症状延长小鼠生存率,而IL-12/15/18激活的NK细胞输注则不影响疾病进程;(2)于移植当天、移植后第7天以及移植后第14天多次输注NK细胞,IL-12/15/18诱导的NK细胞表现出加重移植物抗宿主病的趋势,而IL-12/18对疾病的进展仍发挥了一定的控制作用;(3)混合淋巴细胞反应实验表明IL-12/18激活的NK细胞和对照NK细胞能够明显降低T细胞的异基因反应,而IL-12/15/18刺激的NK细胞则对T细胞的异基因反应未产生明显影响;(4)在超急性移植物抗宿主病模型中,于移植当天单次输注对照NK细胞、IL-12/18或IL-12/15/18激活的NK均能够抑制疾病的进展,并且IL-12/18、IL-12/15/18刺激的NK细胞较对照NK细胞发挥更为显著的抑制移植物抗宿主病效应;(5)IL-12/18、IL-12/15/18诱导的NK细胞在超急性移植物抗宿主病模型中能够明显降低T细胞数量,并且明显降低T细胞中T-bet的表达水平。结论:IL-12/18、IL-12/15/18刺激的供体NK细胞在严重的超急性移植物抗宿主病中能够通过控制T细胞数目及T-bet的表达发挥抑制移植物抗宿主病作用,而在缓和的急性GVHD中,IL-12/15/18诱导的供体NK细胞则未表现出抑制移植物抗宿主病作用,而IL-12/18激活的NK细胞的输注显著控制了受体鼠的a GVHD的病情并延长其生存周期。第三部分供体γδT细胞在异基因造血干细胞移植后移植物抗白血病中的作用与机制目的:研究供体γδT细胞在异基因造血干细胞移植后移植物抗白血病中发挥的作用及其作用机制。方法:体外培养TCRβ-/-小鼠(C57BL/6背景)来源的γδT细胞及其主要亚群Vγ1、Vγ4细胞,流式检测细胞的活化状态和细胞因子分泌水平,细胞毒实验检测Vγ1、Vγ4、γδT细胞对A20细胞的体外直接杀伤水平;以BALB/c小鼠为受体鼠,经清髓辐照后,过继输注野生型C57BL/6小鼠和TCRδ-/-小鼠(C57BL/6背景)的骨髓细胞建立异基因造血干细胞移植移植模型,于移植当天,过继输注小鼠B细胞淋巴瘤A20细胞构建白血病小鼠模型,观察生存并记录体重变化,流式检测移植后各个靶器官中免疫细胞表型、数目和细胞因子分泌情况;在构建的白血病受体鼠中过继输注体外培养的Vγ1、Vγ4、γδT细胞,观察生存并记录体重变化,流式染色检测各脏器中免疫细胞表型;构建白血病小鼠模型,体外培养野生型C57BL/6小鼠、IL-17A-/-小鼠(C57BL/6背景)来源的Vγ4细胞并过继输注到受体鼠内,观察生存并记录体重变化,研究Vγ4细胞分泌的IL-17A在移植物抗白血病中的作用。并对以上实验结果进行统计学分析。结果:(1)当供体γδT细胞缺失时,白血病小鼠的体重下降严重、生存率明显降低,表明供体γδT细胞在体内发挥抗白血病效应;(2)Vγ1、Vγ4、γδT细胞表面高水平表达NKG2D受体,同时可以分泌大量的Granzyme B、TNF-α和IFN-γ,体外对A20有直接杀伤作用,并且在体外发挥主要直接杀伤作用的亚群为Vγ1细胞;(3)当供体γδT细胞缺失时,脾脏、肝脏中CD8+T细胞分泌IFN-γ的量显著降低;(4)过继输注Vγ4细胞能够明显延长白血病小鼠的生存率,有效控制白血病进展,表明其在体内为发挥抗白血病作用的主要细胞亚群;(5)Vγ4细胞分泌的IL-17A在体内发挥了一定的抗肿瘤效应。结论:供体γδT细胞在体内通过调节CD8+T细胞分泌IFN-γ能力发挥抗白血病效应,在体内发挥主要抗白血病效应的亚群为Vγ4细胞。