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流感病毒单股负链分节段的基因组结构特点赋予了重组是流感病毒不断进化、跨种传播和不断流行的重要方式。H5N1高致病性禽流感病毒一直被认为极有可能进化为潜在的大流行毒株,而2009年爆发的甲型H1N1流感病毒（H1N1/2009）及其在猪体内的稳定感染增加了人们对于H5N1可能会与H1N1/2009重组进而产生极具危害性的新型重组病毒的担忧。本研究采用H5N1与H1N1/2009小鼠体内共感染的方式研究这两种病毒重组后子代病毒的基因组成及其致病性,以期揭示它们重组的趋势和特点。氧化应激是体内氧化还原反应失去平衡并倾向于氧化,并由此产生大量的具有高度氧化活性的活性氧物质（ROS）。ROS可以对细胞的多种生物学过程进行调控,如炎性反应和凋亡。NADPH（NOX）氧化酶,是胞内ROS重要的来源之一,对于氧化应激的产生具有重要的作用;而存在于胞内的抗氧化系统能够通过其还原活性对抗或降低过量的氧化反应,如高表达于细胞质中发挥重要抗氧化能力的超氧化物歧化酶1（SOD1）。然而NADPH氧化酶在H5N1高致病性禽流感增殖及致病性的作用,及SOD1是否能通过其抗氧化活性对H5N1增殖和致病性产生影响尚不清楚。基于此我们着重研究了 NOX4和SOD1对H5N1增殖及其致病性的影响,试图揭示ROS在H5N1病毒感染中的意义。正常生理下线粒体处于融合与分裂的动态平衡中,而当胞内生理条件改变或病毒感染等,线粒体动态平衡受到破坏,或倾向于融合/延长,或分裂/片段化。线粒体动态平衡的紊乱不仅能够影响到细胞内能量的产生,对细胞凋亡和免疫反应都具有至关重要的调控作用。本研究以H5N1高致病性禽流感病毒为对象,初步揭示了其能破坏线粒体动态,增强线粒体融合的机制。本研究的主要内容如下:1 H5N1与H1N1/2009基因组兼容性的研究首先我们将H5N1（HM/06）与H1N1/2009（LN/09）共感染小鼠,48h后取小鼠肺脏运用空斑纯化的方法分离纯化出一系列病毒,并对其中624株子代病毒进行基因组测序。在对这624株病毒基因组分析后发现H5N1与H1N1/2009重组后能产生21种不同基因构型的重组病毒,其中H1N1来源的PB2与H5N1的其他七个基因的单基因重组病毒（L1）占到总分离病毒的53.5%,说明这种基因构型的重组病毒是甲型H1N1/2009与H5N1禽流感病毒最兼容的,具有最高的体内重组选择性和几率。而所有的重组病毒都包含有H5N1来源的HA基因,表明H5N1源的HA在病毒重组中的重要性;几乎所有的重组病毒都包含有H1N1/2009来源的PB2基因,间接反映出PB2蛋白对于宿主适应的重要性。2 H5N1与H1N1/2009重组子代病毒的增殖与致病性我们分析了所分离20种重组病毒在A549细胞中的增殖特点,结果表明大部分重组病毒均能很好地在A549细胞中增殖。小鼠攻毒实验发现不同基因构型的重组病毒对小鼠的致病性存在差异。PB2的基因重组病毒（L1）表现出最高的致病性,提示这种基因构型的重组病毒具有潜在的巨大危害。我们的实验说明H5N1和H1N1/2009具有很高的基因兼容性,而PB2的单基因重组病毒具有最高的重组优势和小鼠致病性,提示我们对于该种类型流感病毒监控的重要性。3 NOX4促进H5N1流感病毒的增殖通过实验发现H5N1感染A549细胞后能引起强烈的氧化应激,而NOX4在病毒感染后显著上调。数据表明NOX4的过表达能够促进H5N1诱导的ROS的产生,并能促进H5N1病毒的增殖。沉默NOX4后能够抑制H5N1的增殖,胞内ROS的产生及病毒诱导的炎性反应。4 SOD1过表达抑制H5N1流感病毒的增殖我们发现H5N1感染A549细胞后能显著抑制SOD1的表达。进一步的实验发现SOD1能够显著抑制H5N1流感病毒在A549及小鼠原代肺上皮细胞中的增殖、ROS的产生及病毒诱导的细胞凋亡和炎性因子的表达。5 H5N1感染破坏线粒体动态并增强线粒体融合我们发现H5N1感染A549细胞后能够造成线粒体严重损伤,增强线粒体的融合/延长。进一步的实验发现H5N1感染后能下调重要的线粒体分裂蛋白Drp1和MFF的表达,而Drp1和MFF的沉默能够显著促进H5N1诱导的细胞凋亡,推测H5N1可能通过促进线粒体融合的方式增强细胞的凋亡。6 Drp1和MFF对H5N1病毒复制的不同影响实验证明Drp1能够促进H5N1病毒的增殖,而MFF则能抑制H5N1病毒的增殖;沉默Drp1抑制H5N1增殖的能力可能与其增强的抗病毒免疫有关,而MFF抑制病毒的能力则可能与其正调控抗病毒免疫有关。