【摘 要】
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目的探讨GABRG2基因敲除引起MMP9升高的潜在机制及其在遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（GEFS+）中的作用。方法1.培养小鼠海马神经元细胞系（HT-22细胞）为野生（Wild type,WT）组、GABRG2基因敲除小鼠海马神经元细胞系（PG3-6细胞,由本课题组前期成功构建）为KO（Knockout,KO）组。2.ELISA试剂盒检测细胞的TNF-α分泌量。3.RT-qPCR技术检测GABRG
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81971085）； 宁夏回族自治区“十三五”重大科技项目（2016BZ07）； 宁夏医科大学优势学科群项目（XY201511）；
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目的探讨GABRG2基因敲除引起MMP9升高的潜在机制及其在遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（GEFS+）中的作用。方法1.培养小鼠海马神经元细胞系（HT-22细胞）为野生（Wild type,WT）组、GABRG2基因敲除小鼠海马神经元细胞系（PG3-6细胞,由本课题组前期成功构建）为KO（Knockout,KO）组。2.ELISA试剂盒检测细胞的TNF-α分泌量。3.RT-qPCR技术检测GABRG2、PKA、βRaf、MEK1、ERK1、c-fos、MMP9 mRNA表达量。4.Western blotting技术检测GABRG2、p-PKA、p-βRaf、p-MEK1/2、ERK1/2、c-fos、MMP9蛋白表达量。5.免疫荧光检测MMP9蛋白的表达。6.细胞凋亡检测:运用CCK-8检测细胞存活率及流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果1.鉴定GABRG2基因敲除效率:GABRG2蛋白相对表达量,KO组低于WT组（0.13±0.02 vs.0.32±0.03,P<0.001）差异具有显著性。GABRG2 mRNA的表达,KO组低于WT组（0.62±0.02 vs.1.00±0.03,P<0.001）差异具有显著性。可认为KO组细胞GABRG2基因敲除成功。2.ELISA试剂盒检测细胞TNF-α表达量:细胞培养24 h培养液中TNF-α含量分别为WT组（838.9±37.74）pg/mL,KO组（800.22±90.05）pg/mL,两组细胞间没有统计学差异（P>0.05）。3.RT-qPCR结果:KO组对比WT组:PKA mRNA相对表达量为（1.00±0.72 vs0.89±0.04,P>0.05）,βRaf mRNA相对表达量为（1.31±0.41 vs.1.00±0.08,P>0.05）,MEK1 mRNA相对表达量为（1.00±0.05 vs 1.17±0.10,P>0.05）均无统计学差异;ERK1 mRNA相对表达量为（1.47±0.11 vs.1.00±0.13,P<0.01）,c-fos mRNA相对表达量为（7.26±0.41 vs.1.00±0.09,P<0.001）,MMP9 mRNA相对表达量为（1.41±0.23 vs.1.00±0.10,P<0.05）,KO组均高于WT组。4.Western blotting结果,KO组对比WT组:PKA蛋白（0.66±0.11 vs.0.62±0.12,P>0.05）、βRaf蛋白（0.31±0.03 vs.0.35±0.01,P>0.05）、MEK1/2蛋白（0.75±0.05 vs.0.74±0.08,P>0.05）表达量无明显变化;p-PKA蛋白（0.93±0.02 vs.0.69±0.08,P<0.01）、p-βRaf蛋白（2.54±0.40 vs.1.54±0.18,P<0.001）、p-MEK1/2蛋白（1.00±0.07 vs.0.83±0.03,P<0.05）、ERK1/2蛋白（0.96±0.07vs.0.67±0.07,P<0.01）、c-fos蛋白（0.83±0.04 vs.0.30±0.01,P<0.001）、MMP9蛋白（0.85±0.05 vs.0.63±0.11,P<0.05）表达量均上升。5.免疫荧光检测MMP9蛋白的表达:KO组（422.21±28.31）相较于WT组（319.33±13.97,P<0.01）表达升高。6.CCK-8结果显示:细胞在培养24 h时,WT组的细胞相对存活率（100.00±0.14）%高于KO组（53.90±0.04）%,（P<0.001）;培养48 h时,WT组的细胞存活率（100.00±0.22）%高于KO组（70.38±0.03）%,（P<0.001）。流式细胞术结果,细胞经24 h培养凋亡率KO组比WT组为（24.33±1.15 vs.12.76±1.35）%,（P<0.001）凋亡率升高上升。结论GABRG2基因敲除可能通过激活MAPK途径促进MMP9表达升高引起GEFS+的发生。
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