论文部分内容阅读
目的:以基因芯片技术筛查卡波西肉瘤患者肿瘤组织和瘤旁组织中的circRNA差异性,进行差异性circRNA的生物学功能富集及预测,讨论差异性circRNA可能具备的生物学功能及价值;为进一步研究卡波西肉瘤在非编码RNA领域的调控机制及治疗靶点、提供理论支持。方法:选取冷冻保存的卡波西肉瘤患者肿瘤及瘤旁组织标本五组(男:女=2:3),检验标本质量后提取总RNA之后反转录为cDNA,使用circRNA芯片杂交后进一步扫描筛选出差异性circRNA(筛选标准:差异倍数≥1.5倍,P<0.05);通过计算P值筛选出circRNA,将差异性circRNA导入circBase数据库,及circNet,circ2Trait数据库,查找其转录本、母基因、来源染色体及区域,预测差异性circRNA的miRNA结合位点,并构建circRNA-miRNA-genesymbol(来源母基因)表达网络,预测miRNAs和人类的蛋白质编码基因、长链非编码基因及环状RNA间的相互作用关系,构建了相互作用网络,对miRNAs-circRNA相互作用组中的蛋白编码基因运用基因本体论(Gene Ontology,GO)分析、KEGG富集分析,将差异性的circRNA富集于可能的生物学功能及信号调节通路上。挑选5个circRNA进行逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应验证circRNA差异表达的稳定性及基因芯片筛选结果的可靠性。结果:1.卡波西肉瘤肿瘤组织较瘤旁组织差异表达的circRNA共有550个,其中168个上调的circRNA和382个下调的circRNA,结合位点主要集中于外显子区(筛选标准:P<0.05,且差异倍数改变≥1.5倍)。2.通过GO分析,显示差异表达的circRNA主要富集在R-SMAD蛋白结合、唾液腺形态发生中的分支作用、对焦黏附组件的正向调节、极低密度脂蛋白颗粒、细胞连接组装的正调控、唾液腺发育、小脑皮质形成、唾液腺形态发生、肌节组织、基底板。KEGG富集分析结果提示,差异表达明显的circRNA主要富集于糖胺聚糖降解、不饱和脂肪酸的生物合成、昼夜节律、维生素消化吸收、ECM-受体相互作用等物质代谢相关的通路中。3.挑选富集程度较高的差异性circRNA21个,前100个差异性circRNA,差异通过靶预测程序预测差异circRNAs的潜在靶点miRNA,并与来源母基因并构成circRNA-miRNA-genesymbol关联网络图,发现具有多circRNAs共同调节的miRNA:miRNA-676-5p、miRNA-5193。Y染色体上发现一条差异性hsacirc0092207发生下调。差异较显著地hsacirc0020917,其结合的hsa-miR-575,hsa-miR-4676-5p,hsa-miR-636,hsa-miR-4293,hsa-miR-218-1-3p,在既往111项差异性研究,数十种人肿瘤性疾病中均显示出差异性。低表达hsacirc0022428与hsa-miR-635$66hsa-miR-6774-5p$57 hsa-miR-4253$53 hsa-miR-6862-5p$52 hsa-miR-3945$51等五个预测结合miRNA,均有超过50个结合位点。4.选取5个具有代表性的circRNA(hsacirc0020917、hsacirc0022393、hsacirc0025653、hsacirc0040626、hsacirc0085087)行qRT-PCR验证,差异性结果与原样本芯片测得差异性一致。结论:1.本次研究中发现与KS组织与瘤旁对照组织中存在差异性表达的circRNA,经分析、注释、关联,推测差异表达的circRNAs可能参与了KS发病机制,提示circRNA可能是全新的卡波西肉瘤标记物和潜在的治疗靶点。2.差异表达的circRNAs主要富集于调节细胞分化成熟过程相关分子及与代谢相关通路中。3.Y染色体上hsacirc0092207发生下调可能与男性患者发病相关。4.hsacirc0020917可能是一个潜在的生物标志物分子。