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目的:研究逆转录病毒介导RANKL基因转染对骨髓间充质干细胞（BMSCs）RANKL、OPG表达的影响,探索RANKL基因转染增强BMSCs调控破骨细胞分化能力的可行性,为RANKL基因转染促进骨替代材料降解成骨作用的机制研究提供基础实验依据。方法:全骨髓差速贴壁法分离培养、纯化SD大鼠BMSCs,培养至第三代进行形态学、成骨、成脂分化鉴定。构建、鉴定携带RANKL基因重组逆转录病毒。设置RANKL转染组(BMSCsRANKL)、空载转染组(BMSCsp BABE)、空白组（BMSCs）,RT-qPCR、WB检测重组逆转录病毒转染后RANKL过表达效果。用嘌呤霉素（puro）筛选、收获稳定转染细胞BMSCsRANKL、BMSCspBABE。MTT法检测空白组、RANKL转染组、空载转染组细胞增殖活性;碱性磷酸酶（ALP）活性、ALP染色及茜素红染色法检测RANKL转染诱导组、空白诱导组、空白组细胞的成骨分化能力;RT-qPCR、WB检测RANKL基因转染BMSCs细胞3、7、14、21d三组RANKL、OPG表达变化;免疫组化、免疫荧光双标染色辅助检测转染后第3d三组细胞中RANKL、OPG的表达情况。结果:1.SD大鼠BMSCs分离纯化、鉴定结果:以全骨髓差速贴壁法分离纯化培养得到的大鼠BMSCs,第三代细胞形态均一,呈梭形、短棒状;经过成骨、成脂分化诱导后,碱性磷酸酶染色、茜素红染色、油红?染色均呈阳性。2.逆转录病毒介导RANKL基因转染BMSCs及鉴定结果:pBABE-RANKL-puro重组逆转录病毒载体质粒经SnaBI、SalI双酶切后获得碱基数约为1000bp的条带,测序鉴定结果符合率为100%。病毒转染72h后,RANKL转染组RANKL mRNA、蛋白水平显著上调,高于空白组及空载转染组（P<0.01）,空载转染组与空白组的表达量无显著差异（P>0.05）。3.RANKL基因转染BMSCs对细胞增殖、成骨分化能力及RANKL、OPG表达影响检测结果:RANKL转染组、空白转染组与空白组相比细胞增殖活性无明显改变（P>0.05）;成骨分化能力检测结果显示,成骨诱导14d后RANKL转染诱导组及空白诱导组部分细胞ALP染色呈阳性,成骨诱导21d后RANKL转染组镜下可见钙结节沉积,钙结节体积小于空白诱导组,但数量稍多;RANKL转染诱导组的ALP活性高于空白组（P<0.01）及空白诱导组（P<0.05）。PCR结果显示:基因转染后的3、7、14、21天RANKL转染组的RANKL mRNA相对表达量呈持续稳定高表达,高于空白组及空载转染组（P<0.01）,转染第3d即显著高表达,3-7d增幅较大,7-21d增长趋势平缓;OPG mRNA相对表达量转染第3d低于空白组（P<0.05）,第7d恢复至空白组表达水平,随后缓慢升高（P>0.05）。WB检测结果显示在观察期3-21d内,各时间点RANKL转染组的RANKL表达水平均显著高于空白组、空载转染组（P<0.01）,表达量随时间推移缓慢持续升高。RANKL转染组的OPG表达量在转染后第3d略低于空白组（P>0.05）,7-21d缓慢升高,至21d表达量略高于空白组,表达无显著性差异（P>0.05）;空载转染组RANKL、OPG蛋白表达量与空白组相比无显著差异（P>0.05）。免疫组化、免疫荧光双标共聚焦辅助检测结果显示,RANKL转染组细胞RANKL特异性显色高于空白组及空载转染组,三组细胞OPG特异性显色无明显差异。RANKL/OPG比值变化在mRNA、蛋白水平检测结果相符,RANKL转染组RANKL/OPG比值在3、7、14、21d均显著高于空白组及空载转染组（P<0.01）,比值的相对增量在第7d达到峰值,7-21d缓慢平缓降低;空载转染组各时间点的RANKL/OPG相对表达量比值与对照组无显著差异（P>0.05）。结论:1.重组逆转录病毒p BABE-RANKL-puro转染BMSCs可显著增加其RANKL mRNA及蛋白的表达水平,对OPG表达水平无显著影响。2.RANKL基因转染对BMSCs细胞增殖无显著影响,过表达RANKL基因的BMSCs仍具有成骨分化能力。