【摘 要】
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乳腺发育程度以及乳腺上皮细胞（Mammary epithelial cells,MECs）的数量和分泌活性是影响母羊泌乳性能的关键因素,它们受到诸多功能基因和非编码RNA的调控。Micro RNAs（miRNAs）是一类长度为18-23nt的非编码RNA,它们诱导了靶基因降解或抑制了靶基因转录,最终降低了靶基因表达量。研究表明,miRNAs调控了奶牛、小鼠、奶山羊等物种的产奶量和乳品质。项目组前期
【基金项目】
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国家自然科学基金地区科学基金项目“小尾寒羊泌乳性状相关基因挖掘及其重要miRNA功能研究”（31860635）； 国家自然科学基金地区科学基金项目“小尾寒羊泌乳性状关键circRNAs筛选及其功能研究”（32060746）； 甘肃农业大学2020年青年导师扶持基金项目“miR-432对绵羊泌乳性能的分子调控机制研究”（GAU-QD
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乳腺发育程度以及乳腺上皮细胞（Mammary epithelial cells,MECs）的数量和分泌活性是影响母羊泌乳性能的关键因素,它们受到诸多功能基因和非编码RNA的调控。Micro RNAs（miRNAs）是一类长度为18-23nt的非编码RNA,它们诱导了靶基因降解或抑制了靶基因转录,最终降低了靶基因表达量。研究表明,miRNAs调控了奶牛、小鼠、奶山羊等物种的产奶量和乳品质。项目组前期用small RNA测序技术发现,miR-148a在绵羊泌乳高峰期乳腺组织中的表达量是空怀期乳腺中的2.0倍,说明它参与了乳腺发育和泌乳调控,但目前尚不清楚调控机制。为了揭示miR-148a调控绵羊泌乳性能的分子机理,本研究采用胶原酶I消化法+组织块贴壁、CCK-8、Ed U、流式细胞仪、双荧光素酶报告实验、实时荧光定量PCR（Reverse Transcription-Quantitative PCR,RT-q PCR）等方法,构建了miR-148a在绵羊不同组织中的表达谱,培养了绵羊乳腺上皮细胞,检测了miR-148a对绵羊乳腺上皮细胞的影响,验证了miR-148a与预测靶基因—DNA甲基化转移酶1（DNA Methyltransferase 1,DNMT1）和过氧化物酶体增殖物激活受体1α（Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma Coactivator-1 A,PPARGC1A）间的靶向关系,并研究了miR-148a对靶基因及其其它重要功能基因表达量的影响。主要研究结果如下:1.成功培养了绵羊乳腺上皮细胞,并用免疫荧光法进行了鉴定。2.RT-qPCR结果表明,miR-148a在绵羊乳腺、肝脏、卵巢等8个组织中均表达,但在乳腺中的表达量最高。此外,miR-148a在泌乳期、空怀期和妊娠期的乳腺组织中均表达,但它在泌乳前期的表达量最高,空怀期的最低。3.CCK-8和Ed U检测发现,过表达miR-148a极显著促进了绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖（P＜0.01）,沉默miR-148a则取得了相反的结果（P＜0.01）。RT-q PCR结果表明,过表达miR-148a促进了绵羊乳腺上皮细胞中增殖标志基因CDK2和CDK4的表达（P＜0.01）,沉默miR-148a则降低了这两个基因的表达量（P＜0.05）。流式细胞仪检测发现,过表达miR-148a增加了S期乳腺上皮细胞中的比例,沉默miR-148a则抑制了S期细胞的比例。4.经miRWalk、Target Scan 7.2和miRDB 3种软件的联合分析,发现miR-148a能靶向228个功能基因,DNMT1和PPARGC1A包含在其中。这些靶基因富集在蛋白结合、PI3K-Akt信号通路等重要生物学过程和信号通路上。5.在HEK293T细胞中研究发现,过表达miR-148a显著抑制了DNMT1和PPARGC1A基因野生型载体中海肾酶与萤火虫酶的活性比值（P＜0.01）,而对这两个基因突变型载体的双荧光素酶相对活性无显著影响（P＞0.05）,这表明DNMT1和PPARGC1A是miR-148a的靶基因。进一步在绵羊乳腺上皮细胞中研究发现,过表达miR-148a降低了DNMT1和PPARGC1A基因的表达量（P＜0.01）,沉默miR-148a则提高了它们的表达量（P＜0.01）。6.在绵羊乳腺上皮细胞中,过表达miR-148a提高了甘油三酯的含量（P＜0.05）,以及乳脂合成相关基因DGAT1、m TOR和ABCG2的表达量（P＜0.01）。相反,沉默miR-148a则降低了甘油三酯的含量（P＜0.01）,并降低了m TOR表达量（P＜0.05）。这表明,miR-148a促进了绵羊乳腺上皮细胞的乳脂合成能力。综上所述,miR-148a促进了绵羊乳腺上皮细胞的增殖和活力,同时也提高了甘油三酯的含量以及乳脂合成相关基因DGAT1、mTOR和ABCG2的表达量。
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