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昆虫复杂多样化的色彩模式一直是生态学进化研究的兴趣点所在,因为它们的出现与自然选择息息相关。在鳞翅目昆虫中,家蚕(Bombyx mori)是最适合识别鉴定负责颜色模式基因的模式生物,因为家蚕既存在许多体色突变体,又有基因组序列和高密度连锁图。家蚕体色突变体是研究昆虫体色形成机制的宝贵生物资源。本文以家蚕黄体色抑制突变体i-lem为研究对象,利用转录组测序技术比较i-lem与黄体色突变体lem在转录水平上功能基因和生理代谢通路的差异,通过定位克隆技术筛选 i-lem突变体的候选基因,以期对家蚕 i-lem突变发生的分子机制及其对色素合成调控相关的功能进行探究。主要结果如下: 一、转录组测序方面 1.成功构建了i-lem和lem两个转录组测序文库,Clean reads占Raw reads的比例为98.7%,Q30均高于96.2%,Total Mapped Reads占Clean reads在85.5%左右,其中Uniquely Mapped Reads占Clean reads82.0%左右,Error rate和GC content都控制在合理的范围之内,说明文库的质量合格。 2.2个文库间共发现86个差异表达基因,其中35个上调表达、51个下调表达。对差异表达基因进行GO分析和KEGG分析,分别富集到58个GO term和14条显著性Pathway,所涉及基因的上下调表达可能影响蚕体内多个生理代谢途径。 3. GO分析和KEGG代谢途径中的差异表达基因主要分为两大类:表皮蛋白编码基因和参与昆虫先天性免疫应答系统的基因。28个表皮蛋白编码基因和PAH、Serpin-4等9个昆虫先天性免疫应答系统相关基因以及他们参与的代谢通路,是i-lem突变体与lem突变体之间的主要差异。 二、i-lem定位克隆方面 1.以ah09(+i-lem/+i-lem;lem/lem)和l82(i-lem/i-lem;lem/lem)作为亲本,配制回交BC1M代群体,共收集358头用于i-lem的定位克隆研究。利用四眠期幼虫体色差异鉴别出159头i-lem突变型(浅黄)个体和199头lem突变型(深黄)个体。利用11个可用分子标记在定位克隆群体中成功构建了i-lem连锁图谱,该图谱包含72个交换个体,i-lem基因锁定区域的物理距离约为170 kb,包含11个预测基因。 2.利用GO注释、Smart网站、家蚕基因芯片数据信息以及RT-PCR分析结果表明,预测基因BMgn009799编码的蛋白属于醛酮还原酶(AKR)家族,该基因在i-lem突变体与野生型之间扩增出不同长度的转录本。在+i-lem/+i-lem中转录出含7个外显子的ORF,长度为1026 bp,编码341 aa;而i-lem/i-lem中仅转录出长为270 bp的ORF,只包含第1和第7两个外显子,编码89 aa的缩短型多肽,即BMgn009799在i-lem突变体缺失了外显子2-6。 3.根据文献报道,当墨蝶呤还原酶(SPR)发生功能障碍时,醛酮还原酶(AKR)或羰基还原酶(CR)可以替代SPR参与四氢生物蝶呤(BH4)等蝶呤类色素的合成代谢途径,而lem的突变表型(墨蝶呤大量沉积于体表)正是由于BmSPR的功能不足所致。因此,我们推测BMgn009799编码的AKR家族成员很可能参与i-lem蚕体内的蝶呤类色素合成代谢途径。 综上,我们将定位区域内的预测基因BMgn009799锁定为i-lem突变候选基因。i-lem突变蚕(i-lem/i-lem;lem/lem)通过编码活性更高的AKR在BH4的选择性合成途径中发挥作用,促进较多的蝶呤类色素代谢中间体生成BH4,从而相对减少了墨蝶呤在lem体表的积累,是i-lem对lem具有抑制作用的主要表现。另外,由转录组分析发现的i-lem突变体内的黑色素合成途径被减弱,也可能影响了其幼虫体壁的硬化和着色。因此,相较于 lem突变体,i-lem突变体的幼虫黄体色变淡。