论文部分内容阅读
燃料乙醇作为生物能源的一种,具有悠久的历史,但一直以来燃料乙醇生产成本较高,无法与传统燃料形成竞争优势。据分析,以淀粉质为原料生产燃料乙醇,原料和能耗成本可占总成本的90%,因此采用更廉价的原料并降低能耗是降低燃料乙醇生产成本的主要途径。菊芋(Helianthus tuberosus Linn)和木薯(Manihot esculenta Crantz)作为生产燃料乙醇的原料作物,具有很好的发展潜力。目前,工业上发酵生产乙醇的主要微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),但是酿酒酵母不能直接利用菊粉和淀粉,构建可分泌菊粉酶或淀粉酶的基因工程菌株,可以解决弥补这个缺陷。本论文首先利用基因敲除技术构建了二倍体高产酒精酿酒酵母WO菌株的尿嘧啶缺陷型菌株W12d,并构建了基于rDNA和6序列的并可以与W12d尿嘧啶缺陷互补的多位点整合型表达载体pMIRSC21、pMIRSC11和pMIDSC11。利用W12d和这些载体成功构建了可以直接利用菊粉或淀粉的酿酒酵母工程菌株,并成功用于糖化菊粉或木薯淀粉发酵生产酒精。从海洋藻类藻表面分离得到的季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)菌株1可以向培养基分泌大量的菊粉酶。利用pMIRSC21,将海洋季也蒙毕赤酵母strain1菊粉酶基因INUl整合到酿酒酵母W12d染色体上表达后,重组子PguINU14S-04在YPI液体培养基中,28℃条件下,以180rpm振荡培养72h,菊粉酶活力可达34.5＋0.3U/mL,且PguINU14S-04产酶能力稳定。在5-L发酵罐中,利用PguINU14S-04同步糖化30%(w/v)菊粉发酵生产酒精,经120h发酵,酒精浓度最终可以达到14.7±0.5%(v/v,20),乙醇转化率为1g菊粉可生产0.386g乙醇；同样条件下,发酵50%菊芋干粉提取物,可以得到12.6±0.4%(v/v,20℃)的酒精,总糖利用率91.9±0.5%,乙醇转化率为1g糖可生产0.331g酒精。通过对表达载体和INUl基因进行改造,得到了产菊粉酶能力更强的转化子PguINU14SM-R27,在同样培养条件下,菊粉酶酶活可以达到42.3±0.4U/mL比PguINU14S-04提高了22.6%。利用PguINU14SM-R27同步糖化30%(w/v)菊粉发酵生产酒精,最终可以得到浓度为14.8±0.2%(v/v,20℃)的酒精,乙醇转化率为1g菊粉可生产0.389g乙醇,发酵时间比PguINU14S-04缩短了12h。扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera) IFO0111糖化酶Glm可以催化水解生淀粉,而扣囊复膜孢酵母A11菌株α-淀粉酶Alp1可以加快淀粉的液化。本论文同时利用表达载体pMIRSC11、pMIDSC11实现了扣囊复膜孢酵母A11菌株α-淀粉酶基因ALP1和IFO0111菌株糖化酶基因GLM在酿酒酵母W12d中的共表达,筛选到一个淀粉酶活性较高的转化子AMY-39,经72h振荡培养,α-淀粉酶活性可达22.5±0.5U/mL,糖化酶活性可达14.3±0.4U/mL,淀粉酶总活性可达43.2±0.8U/mL。利用转化子AMY-39糖化20%木薯淀粉生产酒精,经120h发酵,酒精浓度可达10.4±0.2%(v/v,20℃),淀粉利用率89%,酒精转化效率为1g木薯淀粉可生产0.413g乙醇。