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血管性血友病因子（von Willebrand factor,VWF）是最大的血浆糖蛋白,其A1结构域上含有血小板表面受体（glycoproteinΙbα,GPΙbα）的结合位点。生理止血过程中,GPΙbα与VWF A1的相互作用是启动凝止血级联反应至关重要的第一步,它在介导血小板到血管壁面滚动的同时还诱导血小板胞内钙离子和ADP释放,进一步活化整合素αΙΙbβ3,引起胞外钙离子内流,促使血小板稳定粘附。钙离子作为胞内信号转导的第二信使,在细胞的初始粘附、滚动中细胞骨架重排、稳定粘附以及聚集等生理过程中都有着不可或缺的地位。故鉴于VWF A1分子可以介导血小板的初始粘附且VWF A1特定位点的突变会导致出血性疾病的发生,以及钙离子在细胞活化等功能和行为的开启起到的至关重要的作用,本文用平行平板流动腔模拟人体血流环境,探究剪切流下WT-A1以及两个突变体介导的血小板粘附和胞内钙离子释放的差异性。首先,通过IPTG诱导大肠杆菌M15表达WT-A1、2M型突变体A1G1324S和2B型突变体A1R1308L蛋白分子。利用蛋白带有的6个His标签,通过镍柱亲和层析得到单一的目的蛋白。并用SDS-PAGE和Western Blot等实验手段对表达的蛋白进行鉴定。用BCA定量蛋白的浓度,得到0.77 mg的WT-A1,1 mg的A1G1324S,0.57 mg的A1R1308L。接着,利用平行平板流动腔灌注血小板到PBS、2%BSA、WT-A1+2%BSA、A1R1308L+2%BSA、A1G1324S+2%BSA的底板上,结果显示:PBS通过静电作用可以吸附大量的血小板,但2%BSA可以有效阻断物理粘附。实验表达的三种蛋白均可以介导血小板的粘附,血小板的粘附数在A1G1324S、WT-A1、A1R1308L底板上依次增加,由此说明我们表达纯化得到的蛋白分子具有生物学功能。2%BSA在阻断非特异粘附的同时不会影响蛋白与血小板间的特异性粘附,证明本实验室设计的底板功能化方案是成功的,可用此方案研究血小板钙响应过程。最后,我们以Flou-4 AM为胞内钙离子的荧光指示剂,结合平行平板流动腔实验系统和荧光显微镜,实时观测血小板在不同剪切率下流经不同浓度WT-A1及其突变体底板的滚动、黏附后胞内钙离子浓度的变化。通过提取和分析血小板的激活比率、延迟时间、荧光增加比率等实验特征参数,探究力、化学信号和分子的反应动力学差异对钙响应强度及快慢的影响。结果发现血流剪切率和底板分子浓度,正向调节血小板的激活比率,反向调节钙响应的启动时间。剪切率500 s-1时激活比率是静息条件下的37倍。底板WT-A1的浓度从60μg·mL-1提高到240μg·mL-1,钙响应延迟时间缩短10 s。此外,突变导致的VWF A1与血小板亲和力的改变影响了钙响应的激活比率和延迟时间。2B型突变体A1R1308L与WT-A1相比激活比率增加,延迟时间缩短;而2M型突变A1G1324S则相反,激活比率降低,启动钙响应的时间增加。