卵巢早衰(POF)是指妇女在40岁以前因某种原因引起的闭经、不孕、雌激素缺乏以及促性腺激素水平升高为特征的一种疾病。近年来,随着恶性肿瘤发病率的升高,年轻化的趋势明显,而诊治手段的提高使得越来越多的患者生存期延长。化疗作为肿瘤治疗的一种重要手段,在治疗的同时常伴有其不可避免的副反应。化疗所致卵巢早衰,其导致的月经稀发、闭经、第二性征不发育或发育迟缓、不孕、早绝经、心血管系统疾病以及骨质疏松等一系列问题,严重影响年轻女性癌症幸存者的生活质量及身心健康,故怎样修复化疗所致卵巢早衰是目前临床工作亟待解决的难题。目前关于卵巢早衰的治疗取得了一些进展,主要有以下四种方法：1.激素替代治疗；2.促性腺激素释放激素类似物(GnRH-a)卵巢保护治疗；3.胚胎冷冻,卵母细胞冷冻及卵巢组织冷冻卵巢移植治疗；4.胚胎干细胞或骨髓间充质干细胞的移植治疗。但是每一种方法均存在一定局限性,难以从根本上改善卵巢功能,目前仍无法广泛应用于临床。干细胞治疗是指将干细胞输注到病人体内并修复损伤组织和器官的功能。因干细胞具有自我更新,多项分化潜能和归巢效应,目前已用于各种损伤性疾病的研究并取得显著成果。卵巢早衰是组织损伤的一种表现,考虑到既往胚胎干细胞和间充质干细胞的来源问题以及伦理问题,我们将研究焦点集中到具有多向分化潜能的诱导性多潜能干细胞(iPSCs)上。日本的Shinya Yamanaka于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4, Sox2,Klf4和c-M yc)转入小鼠成纤维细胞,首次将已分化的体细胞重新编程得到类似胚胎干细胞样的多潜能干细胞,并命名为诱导多能干细胞(iPSCs)。其来源广泛制备相对简单,不仅具备与胚胎干细胞相同的自我更新和多能分化的潜力,而且不使用胚胎细胞或卵细胞,避免伦理学的问题,同时可以用病人自己的体细胞制备专有的干细胞,不会有免疫排斥的问题,成为极具临床再生医学应用前景的细胞类型。本课题基于Shinya Yamanaka上述发现,拟探索iPS细胞在体外是否能诱导分化为类生殖样细胞的可行性,并在试验动物体内移植iPS细胞对其否能够从生殖内分泌两方面修复化疗所致卵巢早衰进行验证。第一部分iPS细胞向类生殖细胞分化的体外研究目的：探讨iPS细胞在体外是否具有向类生殖细胞分化的潜能。方法：采用颗粒细胞培养上清液诱导iPS细胞分化,在不同时间点观察细胞形态学变化, Elisa法测定培养上清液中雌激素(E2)水平,RT-PCR测定生殖相关基因表达情况等多方面探讨其是否具有向生殖细胞分化的潜能；结果：与对照组相比,iPS细胞自诱导培养后第一天起体积明显增大,呈星形或棱形,丧生干细胞克隆生长特性,发生了分化,有向颗粒细胞分化趋势。细胞培养上清液雌激素水平测定显示：与对照组相比,诱导培养后上清液中E2水平随时间变化不断升高,差别具有统计学意义(P<0.05),提示诱导分化后iPS细胞合成分泌雌激素。RT-PCR结果显示：与对照组相比,诱导后iPS细胞自第一天起开始表达生殖细胞特有标记FSHR和DAZL,并随时间增加表达量逐步升高,差别具有统计学意义(P<0.05),而干细胞标记物OCT-4随时间的变化在诱导后iPS细胞中表达逐步下降,差别具有统计学意义(P<0.05),从基因水平提示iPS细胞在颗粒细胞上清液的诱导下向类生殖细胞样发生了分化。结论：iPS细胞在颗粒细胞培养上清液的诱导下具有向类生殖细胞分化的潜能,为iPS细胞应用于生殖内分泌修复提供了实验基础。第二部分构建并评价化疗所致卵巢早衰的小鼠模型目的：为评价移植iPS细胞后对化疗所致卵巢早衰动物模型的修复作用,首先需建立有效而稳定的卵巢早衰模型。方法：本部分结合文献,选用临床上最广泛应用化疗药物铂类(顺铂)和对卵巢损伤较明确的烷化剂(环磷酰胺)腹腔注射C57小鼠造模,与对照组相比,观察小鼠一般情况,动情周期,血清FSH及雌激素水平,卵巢HE染色,生存曲线等评价比较两者优越性,期望构建稳定可靠地卵巢早衰小鼠动物模型。结果：造模后,化疗各组小鼠相对于正常组小鼠,体重明显下降,活动力减弱,动情周期紊乱,长期处于动情间期。顺铂造模组小鼠死亡明显,至观察14天结束时,7只小鼠死亡5只,而其余组无小鼠死亡,差别具有统计学意义。14天后取材,化疗各组卵巢体积明显缩小,表面皱缩,双侧卵巢湿重明显下降。化疗各组小鼠相对于正常组小鼠血清FSH水平明显升高,E2水平明显下降,差别具有统计学意义(P<0.05)。HE染色显示：造模各组卵巢组织表面皱缩,原始卵泡和初级卵泡明显减少,闭锁卵泡明显增加：其中顺铂组卵泡内颗粒破坏明显呈空泡状。环磷酰胺组纤维化较明显,原始卵母细胞破坏明显呈空洞样。卵泡计数结果显示：化疗各组小鼠总卵泡数明显减少,闭锁卵泡数目增加(P<0.05)。结论：顺铂及环磷酰胺腹腔给药造模均成功。但是顺铂因其卵巢毒性的居中性,采用大剂量一次性给药,全身损害严重,死亡率高,而环磷酰胺因其具有较明确的卵巢毒性损害,实验剂量全身副反应相对较小,无一例死亡,其HE染色见卵巢组织纤维化明显,原始卵母细胞破坏明显,提示其卵巢组织远期恢复可能性小,时间长,可为第三部分实验提供更好的治疗模型。综合比较发现,采用环磷酰胺加白消安较顺铂作为化疗所致卵巢早衰小鼠动物造模更为理想,其节约实验小鼠的数量,时间周期短,成功率高,模型较稳定,可作为探讨卵巢早衰发病机理的动物模型。第三部分移植iPS细胞修复化疗所致卵巢早衰的动物实验研究目的：探讨经尾静脉注射的iPS细胞是否能从生殖及内分泌双方面修复化疗所致卵巢早衰。方法：采用第二部分验证的环磷酰胺和白消安腹腔注射化疗造模。实验分为四组：正常对照组,化疗+iPS组(经尾静脉移植iPS细胞)；化疗+PBS组(PBS为悬浮iPS细胞的溶液)；化疗+MEF组(MEF为导入基因成为iPS细胞前的小鼠胚胎成纤维细胞)。从小鼠一般情况,卵巢功能,iPS细胞定位分化,远期生育能力,子代小鼠观察等多方面评价其疗效。结果：与正常对照组,PBS组,MEF组相比,化疗造模后,iPS组小鼠体重较正常组小鼠体重减轻,但较PBS组和MEF组体重增加,差别具有统计学意义(P<0.05)。小鼠血清性激素水平测定显示,iPS细胞移植组与PBS组和MEF组相比,E2明显升高,而FSH明显下降,但较正常组E2仍下降,FSH升高,差距具有统计学意义(P<0.05)。卵巢HE染色观察,化疗后iPS细胞移植组小鼠卵巢结构较PBS组及MEF组各级卵泡数量明显增多,卵巢结构较规整,但间质纤维化仍然存在,差距具有统计学意义(P<0.05)。冰冻切片免疫荧光示卵巢组织中可见PKH26染色的红色iPS细胞,且部分红色荧光标记的iPS细胞与绿色生殖细胞表面标记MVH共定位。普通PCR结果显示,移植iPS细胞组小鼠卵巢中可检测到iPS细胞特有基因Tet-on的表达,而其他组无表达。各组小鼠与同周龄小鼠(雌雄2：1)合笼连续观察3个月,发现第一个月正常对照组小鼠妊娠率80%(8/10只),iPS组30%(3/10只),PBS组及MEF组10%(1/10只)；第二个月,普通组小鼠妊娠率100%(10/10),MEF组10%(1/10只),iPS细胞组50%(5/10只),而PBS组为0(0/10只);第三个月,普通组小鼠100%,PBS组10%,iPS细胞组50%,而MEF组为0,差别具有统计学意义(P<0.05)。子代小鼠大体外观未见明显异常,无畸形产生。PCR检测结果显示部分子代小鼠表达Tet-on基因。结论：经尾静脉注射的iPS细胞可靶向定位于化疗损伤的卵巢组织,并向生殖细胞分化。移植iPS细胞后小鼠卵巢内分泌及远期生殖能力均有所提高,提示iPS细胞可修复化疗所致卵巢早衰,为我们进一步探索iPS细胞治疗卵巢早衰的机制提供了实验基础。综上所述,本课题从细胞实验验证了iPS细胞有向类生殖细胞分化的潜能,并在体内实验验证经尾静脉iPS细胞可从内分泌及生殖双方面修复环磷酰胺所致C57小鼠卵巢早衰,为干细胞移植治疗卵巢早衰提供了实验基础及理论依据。