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背景: β-内酰胺类抗菌药物是临床常用且有效的抗感染药物,然而由于抗菌药物的不合理使用,导致致病菌的耐药性越来越严重。致病菌对β-内酰胺类抗菌药物的抗性有80%是由于细菌产生的β-内酰胺酶所致。对于细菌产诱导型β-内酰胺酶研究较多的是AmpC产酶系统,尤其是其调节基因ampR,ampD的突变对产酶系统的影响,而对于另一种重要的调节基因ampG则研究较少。在肠杆菌科中,AmpG蛋白作为膜通道蛋白参与细胞壁的再生,并且在有β-内酰胺类抗菌药物胁迫的条件下,具有重要的信号传导功能,在细菌产生AmpCβ-内酰胺酶过程中起到重要作用。 目的: 本文在现有对AmpG基因研究的基础上,借助在NCBI数据库搜集到的不同种属细菌AmpG基因参考序列,结合本研究中对不同来源AmpG基因的测序,分析AmpG基因在不同种属菌株中的多样性;以缺失AmpG基因后的铜绿假单胞菌为受体,通过遗传互补实验,探讨不同种属菌株来源的AmpG基因对糖肽的转运效率的影响,研究AmpG基因结构与功能的关系,为筛选和合成抑制AmpG功能的药物奠定实验基础。 方法: 本文搜集并分类整理NCBI的不同种属细菌基因组的AmpG基因序列,对所得基因序列进行初步的生物信息学分析,同时对其蛋白序列进行结构预测,分析AmpG基因的多样性;通过分子克隆技术,克隆不同种属细菌的AmpG基因;以敲除AmpG基因的铜绿假单胞菌为受体菌,进行克隆AmpG基因的回补实验;,通过测定有关菌株的氨苄抗性水平,分析不同种属菌株来源的AmpG基因的转运糖肽效率,进行AmpG基因的结构与功能关系的研究。 结果: 1、我们在NCBI中搜集到细菌AmpG基因序列498条,蛋白序列2156条,分属不同的种属,包括大肠埃希菌,肺炎克雷伯菌,阴沟杆菌,鲍曼不动杆菌,霍乱弧菌,假结核耶尔森菌,流感嗜血杆菌,沙门氏菌,鼠疫耶尔森氏菌,铜绿假单胞菌,志贺氏菌等多种临床常见菌种。 2、对以上所提到的十一种菌的AmpG基因序列及蛋白序列进行分类整理,并对其蛋白序列进行整合,得到每种菌的蛋白参考序列各一条。并对参考序列进行蛋白跨膜区预测,发现这十一种菌的跨膜区数都在10到14个之间,其中大肠杆菌,肺炎克雷伯菌,假结核耶尔森菌,沙门氏菌,鼠疫耶尔森氏菌,铜绿假单胞菌,阴沟杆菌,志贺氏菌最多为14个;而流感嗜血杆菌,鲍曼不动杆菌较少,分别为12,11个;霍乱弧菌最少,为10个。 3、以铜绿PA01为主要研究对象,其氨基酸序列分别与其他十种菌的AmpG氨基酸序列进行比对,得到铜绿与其他菌氨基酸相似度分别为沙门83%,志贺80%,大肠80%,阴沟77%,肺克77%,霍乱75%,假结核71%,鼠疫71%,流感68%,鲍曼64%。 4、选择大肠杆菌,鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌作为供体菌,将其AmpG基因回补至敲除了AmpG基因的铜绿PA01,发现回补后的PA01△ampG的Amp-MIC由原来的32μg/μl回升到了256,128及256μg/μl。 结论: 通过对各菌AmpG蛋白序列的分析整合,我们发现AmpG蛋白在不同菌中具有多态性,且功能域也略有差别。然而通过实验证明,不同来源的AmpG蛋白在功能上具有相似性,都可以作为AmpC酶表达系统中关键的调控元件之一发挥作用,并且由于AmpG蛋白功能域的些微差别使得细菌对Amp的抗性也出现明显不同,这表明AmpG蛋白功能的发挥与本身功能域的多少,以及与其他调控元件的默契度可能具有密切的关系。