microRNA在骨髓间质干细胞介导的急性肾损伤修复中的作用研究

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目的:探讨大鼠骨髓间质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,rMSCs)在顺铂诱导的大鼠急性肾损伤(acutekidneyinjury,AKI)中通过调控关键microRNA(miRNA)的表达从而发挥修复作用。骨髓间质干细胞(rMSCs)移植AKI大鼠,观察rMSCs对损伤肾的修复作用;miRNA芯片比较筛选出在rMSCs组与PBS组中表达差异的miRNAs分子,体内外实验验证并探寻rMSCs修复肾损伤中的关键miRNAs,揭示rMSCs修复肾损伤的可能分子机制。   方法:以6mg/kg剂量的顺铂经腹腔注射到大鼠体内,建立急性肾损伤实验动物模型。于顺铂注射后的24h以尾静脉注射方式将2×106rMSCs输注到大鼠体内,并分别在损伤不同时间点收集大鼠的血液,检测血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平来评价MSC对肾功能的改善情况,通过活体成像观察rMSCs的组织定位。于顺铂注射后5d处死大鼠,留取肾组织标本,HE染色观察rMSCs对肾组织的修复作用,WesternBlot检测凋亡相关蛋白的表达,免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,TUNEL染色检测肾小管上皮细胞的凋亡情况,综合评价间质干细胞对急性肾损伤的修复作用。在此基础上,留取正常大鼠(对照组),急性肾损伤输注PBS大鼠(PBS组)以及输注rMSCs的大鼠(rMSCs组)的肾组织进行microRNA芯片分析。经芯片比较筛选,选取rMSCs组与PBS组差异显著的miRNAs分子,经qRT-PCR检测并验证这些miRNAs分子在体内外模型中的表达情况。在体内外模型中差异变化一致的miRNAs,进一步研究其下游靶基因及相关信号通路,探讨rMSCs修复肾损伤中可能的分子机制。   结果:体内活体成像结果显示经尾静脉注射的rMSCs能够到达损伤的大鼠肾组织,rMSCs移植组的BUN、Cr水平较PBS组有明显的下降(P<0.05),病理HE染色结果显示rMSCs移植组的肾组织结构比较完整、蛋白管型减少,免疫组织化学与TUNEL染色结果揭示rMSCs能显著增加损伤部位的肾小管上皮细胞的增殖,减少肾小管上皮细胞的凋亡,WesternBlot显示rMSCs移植组的Bax表达下调,Bc1-2的表达上调。microRNA芯片分析显示部分miRNAs分子在PBS组较正常对照组的表达显著增高或降低,而rMSCs可以逆转相应miRNAs分子的表达。选取miR-92b,miR-146b,miR-150*与miR-455进行验证,qRT-PCR验证结果显示miR-146b在体内外模型中变化一致且与芯片结果相符,初步选取miR-146b进行体外功能实验。WesternBlot进一步检测了miR-146b的靶基因表皮生长因子受体(EGFR)在各组中的表达,结果显示在PBS组由于miR-146b高表达,EGFR的表达较低,而rMSCs降低了miR-146b的表达,导致EGFR蛋白表达增加,从而调控其下游Akt相关蛋白通路,在肾损伤中发挥修复作用。   结论:rMSCs的移植对急性肾损伤具有修复作用,该治疗作用的机制可能是间质干细胞通过对miRNAs的调控而发挥组织损伤修复功能。
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