论文部分内容阅读
山羊痘和绵羊痘病(Goat and sheep pox disease)是由羊痘病毒(Capripoxvirus, CPV)感染山羊和绵羊等偶蹄动物引起的一种烈性传染病,病畜以发热、全身性起痘为典型特征。我国目前多使用山羊痘鸡胚化弱毒疫苗预防羊痘病,对羊痘病毒很少有分子病毒学方面的研究。 本实验的目的是以我国广泛使用的山羊痘弱毒疫苗株(GTPV-TY)为模板,通过基因重组等方法构建新型山羊痘病毒基因缺失疫苗。主要进行了以下工作:(1)根据GENBANK公布的羊痘病毒基因组序列设计引物,利用PCR克隆GTPV-TY株TK基因和P32基因;(2)以TK基因或P32基因为目的基因,构建基因缺失转移载体用于同源重组;(3)将LacZ基因表达盒插入TK基因缺失转移载体,筛选TK基因缺失的GTPV-TY突变株。 胸苷激酶基因(TK)是痘病毒的毒力基因之一,而且是病毒生长和复制非必需的基因。试验中首先用PCR方法克隆了GTPV-TY的TK基因,TK基因ORF大小为534bp,编码178个氨基酸,TK的N端具有ATP结合结构域,与其它毒株的TK基因的核苷酸序列比较显示CPV各毒株TK基因的同源性大于96%,保守性很高。为了构建TK基因缺失转移载体,设计了两对引物PRETK1/PRETK2和BACTK1/ACTK2分别扩增得到长度约1kb的TK基因同源重组前臂和同源重组后臂,分别插入到pGEM-T easy载体;通过双酶切的方法鉴定序列的插入方向后,将两段重组臂按照它们在基因组中的排列顺序重新连接起来,构建成pdTK转移载体。pdTK载体人为去除了TK基因ORF内部337bp的核苷酸序列,并且改变了N端ATP结合结构域的氨基酸组成,完全消除了突变株表达TK活性的可能,而且缺失部分不会影响与TK基因相邻的基因结构。两条同源重组臂的连接位置引入了SmaI酶切位点,可以作为外源基因的插入位点。 P32基因是痘苗病毒(VV)H3L基因的同源物,是病毒的囊膜蛋白,根据GENBANK公布的羊痘病毒基因组序列设计引物,用PCR方法克隆了GTPV-TY的P32基因,P32基因ORF大小为969bp,编码323个氨基酸,与其它CPV毒株P32基因的同源性在97%以上,是高度保守的基因。参照构建pdTK转移载体的方法,构建了pdP32转移载体,人为除去了P32基因包括起始密码子在内的525bp的核苷酸序列,完全消除了突变株表达P32蛋白的可能,而且缺失部分不会影响与P32基因相邻的基因结构。同源重组臂之间也带有SmaI酶切位点,以便插入外源基因。 重组病毒的筛选标记为自行构建的LacZ基因表达盒,其中LacZ片段通过限制性内切酶酶切从质粒pcDNA 3.1/His/LacZ中获得,Pcmv启动子序列通过PCR方法从质粒pcDNA 5_TO中获得;插入pGEM-T easy载体,构建成LacZ基因表达盒pCMV-LacZ,从中切下CMV-LacZ片段插入pdTK,构建成pdTK/LacZ质粒。将pdTK/LacZ利用脂质体方法转染已经感染GTPV-TY毒的羊胎皮肤细胞,当大部分细胞出现病变时,收获病毒,再用X-gal筛选蓝色蚀斑连续纯化4代,得到重组病毒TK~-/LacZ~+GTPV-TY突变株,重组病毒经电子显微镜检验,形态与正常病毒相同,提取重组病毒DNA并使用LacZ基因特异引物Id1/Id2进行PCR扩增,可以得到0.4kb的特异片段,证明重组病毒构建成功。