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目的:首先,根据加味过敏煎的功效应用,从“肝肺同治”的角度初步推理其治疗过敏性哮喘的中医机制;其次,在动物实验上,运用卵白蛋白(OVA)致敏与激发制备哮喘小鼠模型,观察加味过敏煎治疗过敏性哮喘的药效作用,并进一步探讨加味过敏煎抗敏、抗炎、平喘的免疫分子机制及作用靶点,为将此方开发为新型、安全、有效地治疗哮喘的药物提供理论与实验基础,也为临床使用该方治疗过敏性疾病提供科学可靠的实验依据。方法:1加味过敏煎治疗过敏性哮喘的中医机制研究1.1过敏性哮喘中医证候规律的现代文献研究对符合要求的文献中所涉及的证型、脏腑、病理因素和治疗方法进行规范,运用SPSS17.0进行频次描述;1.2从“肝肺同治”论治过敏性哮喘的理论研究:采用文献整理、对比、分析、归纳和总结的方法。2加味过敏煎治疗过敏性哮喘的药效学研究将60只4～5周SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为6组:空白对照组、模型对照组、地塞米松阳性对照组(1.25mg·kg-1)、加味过敏煎高剂量组(含生药2.72g/ml)、加味过敏煎中剂量组(含生药1.36g/ml)、加味过敏煎低剂量组(含生药0.68g/ml),每组10只。采用OVA致敏和激发构建小鼠哮喘模型。观察激发时小鼠的发作表现;细胞涂片进行外周血中白细胞分类计数;HE染色观察肺组织病理切片炎性细胞浸润情况;采用ELISA法检测小鼠血清中OVA特异性IgE(OVA-sIgE)的含量。3加味过敏煎治疗过敏性哮喘的免疫分子机制研究分组与造模法同上。采用流式细胞技术(FCM)检测哮喘小鼠T细胞中CD4~+IFN-γ~+细胞、CD4~+IL-4~+细胞、CD4~+IL-17~+细胞、CD4~+Foxp3~+细胞占CD4~+T细胞的比例的变化;采用ELISA法检测小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4、IL-5的表达水平;采用RT-PCR法检测小鼠肺组织中IFN-γ和IL-4、IL-5的mRNA表达水平;采用实时荧光定量PCR法和WB法检测小鼠肺组织中转录因子T-bet、GATA-3、Foxp3的mRNA与蛋白表达水平。结果:1加味过敏煎治疗过敏性哮喘的中医机制研究1.1过敏性哮喘中医证候规律的现代文献研究按照频次进行排序,过敏性哮喘中最常见的12个实证证型依次为:寒哮、热哮、痰热郁肺、肝火犯肺(木火刑金)、寒痰阻肺、风痰内阻、痰浊阻肺、风邪外袭、痰瘀阻肺、肝气乘肺、风寒袭肺、风热犯肺;最常见的6个虚证证型依次为:肺肾两虚、肺气虚、肺肝肾阴虚、肺脾两虚、脾气虚、肾阳虚;此外,还有6种虚实夹杂证候(肺寒肾虚、肺热肾虚、气虚血瘀、肝血亏虚,肝风内动、肺热阴虚、肾虚痰瘀);过敏性哮喘关联的脏腑按频次排序有:肺、脾、肾、肝、胃、心、小肠;过敏性哮喘涉及的病理因素按频次排序依次为:痰、虚、风、气郁、寒、瘀、热(火)、湿、燥、暑;按频次排序,最常用的治疗方法前12位依次为:化痰、清热、宣肺平喘、调肝(包括补肝、疏肝、清肝)、祛风、温肺散寒、活血化瘀、补益肺肾、补益肺脾、健脾益气、扶正祛邪、豁痰利气。1.2从“肝肺同治”论治过敏性哮喘的理论研究我们认为,哮证是综合因素、多病机结合的一种病证,肝肺是引发哮喘的关键脏腑,风、气、痰、瘀、虚等病理因素的产生与发展都离不开肝肺。而过敏性哮喘具有明显的季节性,好发于春季,以风邪为致病先导,更是与肝肺相关。过敏性哮喘具体的病机可概括为“肝肺气阴亏虚为本,风邪袭肺为标,肝之阴血亏虚导致肝阳偏亢,肝阳化内风,终至内外风相煽,痰气瘀互阻,气道搏结,哮喘乃发”。治疗的原则就是从“肝肺同治”立法,以“调肝理肺,滋阴祛风,化痰通络”为根本治法。而加味过敏煎就是针对此病机,并谨守此原则来治疗过敏性哮喘的代表方。2加味过敏煎治疗过敏性哮喘的药效学研究与模型组比较,各加味过敏煎治疗组小鼠哮喘发作表现如喷嚏、呛咳、呼吸急促、躁动不安、腹肌收缩、紫绀等症状明显减轻(P<0. 01～0.05);加味过敏煎高、中剂量组均能明显减少外周血中白细胞总数与嗜酸性粒细胞(EOS)比例(P<0. 01～0.05);加味过敏煎高、中剂量组均可不同程度的改善肺组织炎性病变,EOS浸润减少(P<0. 01～0.05);加味过敏煎各剂量组均可显著降低血清中OVA-sIgE含量(P<0.01～0. 05)。3加味过敏煎治疗过敏性哮喘的免疫分子机制研究3.1加味过敏煎对CD4~+T细胞亚群及细胞因子分化与功能的影响FCM技术检测结果显示:与模型组比较,加味过敏煎高剂量组可明显降低脾组织中CD4~+IL-4~+、CD4~+IL-17~+细胞占CD4~+细胞的比例(P<0.05);加味过敏煎中、低剂量组则有降低的趋势,但没有有统计学意义(P>0.05);加味过敏煎高剂量组可明显增加CD4~+IFN-γ~+细胞占CD4~+细胞的比例(P<0. 05);加味过敏煎中、低剂量组则有增加的趋势,但没有统计学意义(P>0. 05);加味过敏煎高、中剂量组对CD4~+Foxp3~+细胞占CD4~+细胞的比例有增加趋势,但没有统计学意义(P>0. 05)。3. 2加味过敏煎对血清中Th1/Th2型细胞因子表达水平的影响ELISA结果显示:与模型组比较,加味过敏煎高剂量组可显著降低血清中IL-4含量(P<0. 01),而加味过敏煎中、低剂量组有降低趋势,但无统计学差异(P>0.05);加味过敏煎高、中剂量组均可降低血清中IL-5水平(P<0. 05),而加味过敏煎低剂量组有降低趋势,但无统计学差异(P>0.05);加味过敏煎高、中剂量组均可显著提高血清中IFN-γ含量(P<0.01～0.05),而加味过敏煎低剂量组有升高趋势,但无统计学差异(P>0. 05)。3. 3加味过敏煎对肺组织中Th1/Th2型细胞因子mRNA表达的影响RT-PCR结果显示:与模型组比较,加味过敏煎各剂量组均可明显降低肺组织中IL-4、IL-5 mRNA表达水平(P<0.01～0.05);加味过敏煎高剂量组升高了 IFN-γmRNA表达水平(P<0.05),其余各组均无明显表现(P>0.05),但有升高的趋势。3. 4加味过敏煎对肺组织中转录因子mRNA表达与蛋白表达的影响研究实时荧光定量PCR结果显示:与模型组比较,加味过敏煎高、中剂量组均可明显降低肺组织中Th2型细胞转录因子GATA-3的mRNA表达水平(P<0. 01～0.05),其中加味过敏煎高剂量组比较显著(P<0.01);加味过敏煎高剂量组可增强Th1型细胞转录因子T-bet和Treg细胞特异性转录因子Foxp3的mRNA表达水平(P<0. 01～0.05);加味过敏煎中、低剂量组均可升高Foxp3的mRNA表达水平(P<0. 01～0.05);加味过敏煎中、低剂量组对T-bet表达水平有升高的趋势(P>0.05);加味过敏低剂量组对GATA-3的mRNA表达水平有降低的趋势(P>0.05)。WB结果显示:与模型组比较,加味过敏煎高、中剂量组均能显著抑制GATA-3的蛋白表达(P<0.01～0. 05);而对T-bet、Foxp3的蛋白表达则有不同程度的提高,但无统计学差异(P>0. 05)。结论:1根据文献统计,肝、肺与过敏性哮喘的关系是非常紧密的,虽然哮喘不仅仅与此二脏相关,但此二脏却是引发哮喘发作(急性期)最为关键的脏腑,从证型、病理要素的生成、治疗方法等方面看离不开肝肺生理病理的变化,而且与肝肺相关的证型、病理要素、治法都处在非常重要的地位。2理论研究发现,加味过敏煎是从“肝肺同治”立法,以“调肝理肺,滋阴祛风,化痰通络”为根本治法治疗过敏性哮喘的代表方。加味过敏煎药物皆归肝肺经,全方肝肺同治,表里兼顾,阴阳并调,功在疏畅气机,外散风邪,内调肝肺,化痰通络,有收有散,有补有泻,升降并举,使风、痰、瘀不得相结,不得化生,祛邪且扶正,收效甚佳。3加味过敏煎可明显减轻激发时哮喘小鼠的发作表现,可减少哮喘小鼠体内白细胞总数与嗜酸性粒细胞(EOS)比例,可改善肺组织炎性病变,减少EOS浸润,并减少哮喘小鼠体内OVA-sIgE含量,进一步证实了加味过敏煎具有抗敏、抗炎、平喘的药效作用。4加味过敏煎治疗过敏性哮喘的免疫机制可能是:①调节Th1/Th2细胞分化失衡:即增强哮喘小鼠脾组织中Th1型细胞亚型在CD4~+细胞中的比例;降低Th2型细胞亚群在CD4~+细胞中的比例;还可上调Th1型细胞因子IFN-Y的表达,抑制IL-4、IL-5等Th2型细胞因子的表达;还可明显抑制哮喘小鼠肺组织中Th2型转录因子GATA-3的基因与蛋白表达水平,增强Th1型转录因子T-bet基因表达水平。②调节Treg/Th17细胞的分化失衡:即可降低Th17型细胞亚群在CD4~+细胞中的比例,还可上调Treg细胞特异性转录因子Foxp3的基因表达。