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小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是一种严重的烈性、接触性传染病,主要感染小反刍兽,特别是山羊高度易感,FAO/OIE规定必须通报的烈性传染病,我国也将其列为一类动物疫病。目前,我国还没有诊断PPR的商品化试剂盒,为此,我们对已经初步建立了的间接ELISA方法进行进一步的验证和优化,提高该方法的稳定性、重复性,使试验结果切实,科学有效,能够应用到临床实践中。主要研究内容包括:1. pET-PPRV-N重组质粒的鉴定和蛋白表达条件的标化应用PCR和酶切对重组质粒进行鉴定,并探索不同表达条件,结果1.0mM的IPTG诱导6h表达量最高。根据标化的表达条件,大量表达PPRV-N蛋白,应用层析方法纯化目的蛋白,作为间接ELISA的包被抗原。2.间接ELISA检测方法的优化本研究对PPR间接ELISA的抗原包被浓度、血清稀释浓度、封闭液、封闭时间、血清稀释液、血清作用时间、二抗和底物作用时间等方面作了改进,降低了阴性背景值,提高了阳性值,验证了ELISA方法的稳定性。此外,根据标定的ELISA程序,比较两个不同批次的抗原,结果表明两者具有很高的符合率,达95%。用PPRV试剂盒检测羊的其它常见病阳性血清,结果为阴性,说明试剂盒具有良好的特异性。3.与竞争ELISA试剂盒比较确定间接ELISA的临界值选择不同来源(自然感染、疫苗免疫以及健康未免疫羊)羊血清244份,用竞争ELISA检测确定阳性和阴性血清,同时用间接ELISA检测,分析阳性以及阴性的OD值分布规律,并利用TG-ROC软件进行分析,选择自信度为95%,判定阴阳性血清的临界OD值为0.227。确定间接ELISA检测方法的敏感性和特异性分别为85.4%,98.6%。4. PPR ELISA方法在临床诊断中的应用应用间接ELISA以及竞争ELISA试剂盒检测西藏、青海、新疆等地的血清样品,对试验结果进行比对分析,两种方法具有较好的符合率,进一步验证该方法。目前,还没有可行的方法区分PPRV自然感染和疫苗免疫个体血清抗体。在比较分析自然感染、疫苗免羊群血清的ELISA抗体滴度,发现群体抗体水平存在显著差异,自然感染羊群体抗体介于1:800-1:1600,而疫苗免疫的只能达到1:20-1:400,这种利用群体抗体比较的方法有望实现这一目标。5.西藏阿里地区PPRV流行病学调查研究2007年7月,我国西藏阿里地区首次证实爆发小反刍兽疫疫情,为了认识小反刍兽疫疫情在我国的地理分布、宿主范围等流行状况,我们开展了以血清学和病原学为基础,并结合现场调查的研究。结果表明疫情于2005年冬从边境传到日土县热角村,通过混群、混牧以及引种等方式将疫情进一步扩散,到2007年9月,PPR在阿里地区日土县、改则县、革吉县、札达县发生。