论文部分内容阅读
EB病毒(EBV)是1964年由Epstein和Barr在对非洲Bμrkitt淋巴瘤来源的肿瘤细胞进行体外培养时发现的。研究证明EBV与多种人类肿瘤的发生,发展相关,包括Bμrkitt’s淋巴瘤(BL)、鼻咽癌(NPC)、何杰金氏病(HD)、T细胞淋巴瘤及免疫抑制引起的免疫增生型淋巴瘤等。NPC是我国南方和东南亚地区一种常见的恶性肿瘤,在广东、广西某些地区鼻咽癌占肿瘤病死率的第一或第二位,是我国重点防治的十大肿瘤之一。目前,鼻咽癌的首选治疗方法是放射治疗,一旦复发和转移以后,85%的病人在一年内死亡,其余的病人在三年内全部死亡。NPC的显著特点是在低分化的鼻咽癌肿瘤细胞中EB病毒的检出率几乎是100%,而在肿瘤周围正常组织细胞中EB病毒为阴性。与EBV健康携带者相比,鼻咽癌患者体内针对EBV的特异性CTL反应较弱,因此增强机体CTL应答在清除病毒感染和肿瘤免疫监视的过程中起着十分重要的作用。EB病毒在不同的肿瘤细胞中表达不同的抗原,在NPC中,主要表达核心抗原1(EBNA)潜伏膜蛋白1(LMP1)和潜伏膜蛋白2(LMP2)目前针对EB病毒疫苗方面的研究多集中在LMP1和LMP2上,我们前期的研究中显示：LMP2在一些在食蟹猴中所诱导的免疫应答较弱。在一些个体中单独LMP1和LMP2所诱导的特异性CTL也较弱。在此研究基础上,我们拟构建LMP1△(去除致癌部分)和LMP2的融合基因来增强LMP1△和LMP2为靶点的细胞免疫反应。通过构建LMP1△及LMP2融合基因,同时诱发两种抗原LMP1和LMP2的特异性CTL,探讨LMP1△和LMP2在诱导特异性CTL方面是否具有协同效应,通过增强个体特异性免疫应答,来克服肿瘤的免疫逃逸从而提高免疫治疗效果。我们首先构建真核表达载体pCDNA3.1-LMP1Δ-his,通过酶切及测序证实LMPl△基因正确插入pCDNA3.1(+)-his质粒载体中,间接免疫荧光实验确认LMPl△基因在293细胞中能有效表达。构建了真核表达载体pCDNA3.1-LMP2-LMP1Δ,酶切及测序结果证实LMP2-LMP1Δ融合基因正确插入pCDNA3.1(+)-his质粒载体中,间接免疫荧光实验及Western Blot法检测确认LMP2-LMPl△融合基因在293细胞中能有效表达。利用制备及纯化pcDNA3.1-LMP1Δ、pcDNA3.1-LMP2-LMP1Δ及本课题组已经制备好的pcDNA3.1-LMP2,rAd-LMP2,rAd-LMP1Δ单独及几种联合免疫BalB/C小鼠,于0,2,4周免疫三次,末次免疫后1周取小鼠脾淋巴细胞,应用IFN-γELISPOT检测特异CTL水平。结果表明,单独pCDNA3.1-LMP1Δ和rAd-LMP1Δ疫苗免疫诱导,所形成CTL／106淋巴细胞与PBS组比较无统计学意义。单独的腺病毒疫苗rAd-LMP2免疫小鼠,生成500个CTL／106淋巴细胞。在联合免疫组中,pCDNA3.1-LMP1Δ初免,rAd-LMP1Δ加强免疫,免疫效果较弱,所形成CTL／106淋巴细胞与PBS组比较差别无统计学意义。pCDNA3.1-LMP2初免,rAd-LMP2加强免疫,组平均数可达705个CTL／106淋巴细胞。pCDNA3.1-LMP2-LMP1Δ初免,rAd-LMP2和rAd-LMP1Δ加强免疫,组平均数可达960个CTL／106淋巴细胞。pCDNA3.1-LMP2和pCDNA-3.1LMP1Δ初免,rAd-LMP2和rAd-LMP1Δ加强免疫,组平均数可达1000个CTL／106淋巴细胞。结论,我们构建了真核表达载体pCDNA3.1-LMP2-LMP1Δ, pCDNA3.1-LMP1Δ-his,并证明该真核表达载体可以在细胞中有效表达目的基因,在小鼠免疫结果显示：不同的免疫组合在小鼠体内诱发不同强度的CTL反应,其中pCDNA3.1-LMP2-LMP1Δ初免,rAd-LMP2和rAd-LMP1Δ加强免疫；pCDNA3.1-LMP2和pCDNA-3.1-LMP1Δ初免,rAd-LMP2和rAd-LMP1Δ加强免疫在小鼠体内诱发更强的CTL反应。