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ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFAS)是人类的必须脂肪酸,若人类机体细胞中ω-6/ω-3 PUFAS的比例大于18将导致各种细胞的病变和人体功能性障碍等疾病的频发,如增加患乳腺癌、大肠癌和前列腺癌的几率。然而哺乳动物体内不含有编码ω-3 PLJFAS的fat-1基因,要改变哺乳动物机体内ω-3 PUFAS的含量,现代转基因技术使之成为可能。本试验以15～17曰胚龄的比利时兔胚胎和小秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为实验材料,研究线虫fat-1基因在家兔中的表达,为培育富含ω-3 PUFAS的转基因动物建立动物模型具有重要的理论依据和实践意义。
本次实验采用组织块培养方法,成功培养出家兔成纤维细胞。
通过PCR方法克隆得到线虫fat-1基因CDS区全序列,经生物信息学分析,结果显示线虫fat-1基因CDS区序列全长为1209bp,编码402个氨基酸,其编码的蛋白质等电点为6.14,分子量为46.5KD,属于跨膜蛋白超家族成员,具有一个FADS结构域,二级结构主要以72-223及232-281氨基酸位点间的两个α螺旋结构为基础。
选择限制性内切酶EcoR I和BamH I对重组质粒pMD19-T-fat-1和真核表达载体pEGFP-N1进行双酶切,再将fat-1基因片段与真核表达质粒载体骨架pEGFP-N1相连得到重组真核表达载体pfat-1-GFP。重组载体转染家兔成纤维细胞48h后,成功转入目的基因的细胞在荧光倒置显微镜下会发出荧光。取转染成功的细胞进行裂解释放蛋白,做Westernblot检测,得到大小约为47KD的条带,与fat-1翻译后产物的理论值46.5KD大小相符,表明线虫fat-1基因在家兔成纤维细胞中成功得到了表达。